基于高通量測序的土壤細菌組成、豐度及多樣性分析

范 娜，彭之東，白文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所，高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點實驗室，山西晉中 030600）

0 引言

土壤鹽漬化影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個主要因素[1]。全球大約20%的耕地為鹽堿地，還有一半的灌溉地正在演化為鹽漬地[2]，且呈逐年增長的趨勢。鹽堿地會影響土壤中微生物群落組成、數(shù)量及其分布。鹽脅迫降低土壤微生物的活性、微生物碳、氮量，從而導(dǎo)致有機質(zhì)被微生物分解的能力下降，土壤質(zhì)量降低必然導(dǎo)致作物出苗、生長及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運，營養(yǎng)生長和生殖生長受抑制，產(chǎn)量減少甚至絕收。

利用耐鹽植物是改良鹽堿地的有效方式之一。植物的耐鹽性因種類、品種不同而耐鹽性有所區(qū)別，培育并篩選出耐鹽品種、挖掘作物的耐鹽特性應(yīng)用于鹽堿地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以緩解鹽漬化對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響[3]。高粱是全球五大作物之一，抗逆性強，是鹽堿農(nóng)田生長的先鋒作物、相對高產(chǎn)作物[4]。

山西省太原市清徐縣孟封村自然地理條件特殊，鹽漬化問題困擾當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。本研究選用10份不同的高粱親本材料在鹽堿地進行大田鑒選試驗，同時采集清徐縣鹽堿地土壤樣品，采用Illumina Miseq高通量測序方法相結(jié)合研究鹽堿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，旨在為高粱耐鹽材料的篩選及耐鹽性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗地基本情況 試驗于2017年5月—2019年10月在山西省太原市清徐縣孟封村進行。清徐縣屬暖溫帶大陸性氣候，年平均日照為2577.5 h，年平均氣溫為9.6～10.2℃，年均降水量為462 mm。土壤基礎(chǔ)理化性狀：pH 7.89、EC值1214.10 mS/cm、有機質(zhì)10.04 g/kg、全氮0.07 g/kg、速效磷8.60 mg/kg、速效鉀172.13 mg/kg。

1.1.2 試驗材料 本實驗室前期通過室內(nèi)試驗和大田試驗從400 份典型材料里篩選出10 份材料，分別為622-2、1012、1090、473、342、68、1187、67、135、366。

1.2 樣品采集與分析

1.2.1 土壤理化性狀的測定 土壤有機質(zhì)測定采用重鉻酸鉀容量法，土壤全氮采用半微量凱氏定氮法，土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提、鉬銻抗顯色分光光度法，土壤速效鉀采用醋酸銨提取火焰光度法測定[4]。

1.2.2 樣品采集 土樣取樣深度為0～10 cm，每處取5個土樣，4℃下運輸至實驗室，用于測定其相關(guān)理化性質(zhì)，部分樣品經(jīng)冷凍干燥后保存在-80℃超低溫冰箱中用于DNA 提取和后續(xù)分子生物學(xué)試驗，充分混合用于DNA提取和高通量測序[5]。

1.3 高通量測序方法

采用高通量測序平臺軟件對數(shù)據(jù)處理、進行OTU聚類分析、3Alpha 多樣性分析、物種分類分析和多維度分析：基于OTU聚類分析和物種分類的共有分析。

1.4 種子生長指標(biāo)

第3天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第6天統(tǒng)計發(fā)芽率和相對鹽害率，計算公式如(1)～(4)所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾和雙端序列的連接，應(yīng)用軟件cutadapt和Usearch對連接上的序列進行過濾和去除嵌合體。然后對得到的優(yōu)質(zhì)序列基于97%的相似水平上進行OTU 聚類，并利用Usearch。數(shù)據(jù)庫進行物種注釋[6-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料耐鹽測定

2.1.1 種子萌發(fā)生長情況 發(fā)芽率反映種子發(fā)芽的多少。從表1 可以看出：10 份高粱親本材料發(fā)芽率的數(shù)值范圍為44.1%～93.4%，其中材料473、342、67 發(fā)芽指標(biāo)較高，表現(xiàn)出比較好的生長趨勢；材料68、622-2 發(fā)芽指標(biāo)較低。發(fā)芽率與材料耐鹽性呈正相關(guān)。

表1 鹽堿對高粱萌發(fā)的影響

2.1.2 鹽脅迫對高粱苗期生長的影響 由表2 可以看出，473、342 生長速率較快，表現(xiàn)出較強的耐鹽性；材料68、622-2 生長指標(biāo)數(shù)值較低。耐鹽材料鹽害系數(shù)低于鹽敏材料。

表2 鹽脅迫對高粱苗期生長速率的影響

2.2 樣品測序

采用Usearch 軟件去除預(yù)處理后序列中非擴增區(qū)域序列，對測序錯誤進行校正，調(diào)用uchime 進行鑒定嵌合體，將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進行blastn 比對，低于閾值的比對結(jié)果認為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列[9]。測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表3。

表3 樣品測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.3 鹽堿地土壤細菌組成及豐度

OTU (Operational Taxonomic Units)指的是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究當(dāng)中，為了便于分析，人為的給每個分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志。通常在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取OTU聚類中的代表性序列[11]。

由圖1 可知，10 個材料共有OTU 數(shù)為38 個，QTU總數(shù)為2109 個，其中樣品342 特有的OTU 數(shù)為293個，樣品67 特有的OTU 數(shù)為133 個，樣品322 特有的OTU 數(shù)為240 個，樣品68 特有的OTU 數(shù)為133 個，樣品135特有的OTU數(shù)為160個，樣品1060特有的OTU數(shù)為262 個，樣品1187 特有的OTU 數(shù)為241 個，樣品366 特有的OTU 數(shù)為255 個，樣品473 特有的OTU 數(shù)為137 個，樣品1012 特有的OTU 數(shù)為255 個。耐鹽材料OTU數(shù)量較多，表明土壤中微生物的群體數(shù)量與作物生長速率呈正相關(guān)。

圖1 基于OTU豐度的樣本聚類圖

2.4 多樣性指數(shù)分析

豐富度指數(shù)（Chao1 指數(shù)）高低代表群落或生境中物種數(shù)目和復(fù)雜度[12]。優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson 指數(shù)）表示一個群落或生境中優(yōu)勢種的地位和作用，值越高說明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢種的地位越突出；多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)）與群落多樣性指數(shù)成反比[13]。

土壤細菌的數(shù)量大，個體小，代謝強繁殖快，是土壤微生物的主要組成部分，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，它能分解土壤中各種有機質(zhì)，由表4 可知，樣品342、473 的Chao1、ACE 和Shannon 指 數(shù) 均 最 高，Simpson指數(shù)最小，該材料的物種多樣性最高；相反鹽敏材料68、622 的Chao1、ACE 和Shan?non 指數(shù)均最低，Simpson指數(shù)最大，多樣性最低。耐鹽材料土壤中細菌種類數(shù)量多，土壤微生物的群體數(shù)量，微生物數(shù)量的增加及其生長速率的增大可有效地促進土壤酶的活性，為微生物的生長提供了較多更易利用的碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)。

表4 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.5 主成分分析

采用PCA 主成分分析，結(jié)果表明：主成分1(PCA1)、主成分2(PCA2)和主成分3(PCA3)樣品差異性貢獻率分別達到42.0%、25.0%和19.0%，三者合計達到86.0%，是差異的主要來源。由圖2 可知，1090 和1187 位于PC1 負值區(qū)、PC2 和PC3 的正值；1012 位于PC1 的負值區(qū)域，PC2 的正值區(qū)域及PC3 的正負兩側(cè)。622位于PC1的負值區(qū)域，PC2的正值區(qū)域及PC3的負區(qū)域，其余的位于PC1、PC2 的負值區(qū)域，PC3 的正值區(qū)域。說明樣品間的主成分變異顯著。

圖2 主成分分析

3 結(jié)論與討論

土壤微生物群落在物質(zhì)循環(huán)、腐殖質(zhì)分解、化學(xué)元素轉(zhuǎn)化和土壤質(zhì)地改良等方面起著重要作用，其豐富度和多樣性是維持作物生長、發(fā)育的前提條件。鹽脅迫影響土壤微生物群落組成、數(shù)量及其分布，使微生物對土壤養(yǎng)分的分解作用下降[20]。

本實驗采用高通量測序技術(shù)對其細菌群落組成進行初步分析。在97%的相似度水平上，10個材料共有OTU 數(shù)為38 個，其中樣品342 特有的OTU 數(shù)最多為293 個，樣品,68特有的OTU 數(shù)最少為133 個。其中變形菌門為第一優(yōu)勢菌群。這與李新等對內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度的土壤細菌研究結(jié)果一致、本研究中10個樣品共同的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬，說明其分布廣泛。此類菌屬具有耐鹽特性，群落中各物種具有越大的均勻度則群落具有越大的多樣性。