不同壇紫菜絲狀體生化性狀的比較研究

陸彩萍 楊 銳 駱其君 陳娟娟 張 鵬 王鐵桿 陳海敏

(1. 寧波大學食品與藥學學院, 寧波 315211; 2. 寧波大學海洋學院, 浙江省海洋生物工程重點實驗室, 寧波 315211;3. 浙江省海洋水產養殖研究所, 溫州 325005)

壇紫菜(Neoporphyra haitanensis)作為我國特有的一種暖溫帶大型藻類, 主要在浙江和福建等南方沿海地區進行栽培, 其年產量約占全國紫菜總產量的75%, 具有非常重要的經濟作用[1]。然而, 與其他人工栽培海藻的情況類似, 目前壇紫菜也面臨著抗病性差和種質退化等問題[2]。因此, 研究者致力于通過品種選育, 尋找性狀更優良、適應性和抗病能力強的新品種。

壇紫菜生長經歷絲狀體和葉狀體2個世代, 自由絲狀體處于營養生長階段, 在沒有環境改變的情況下, 其生長狀態和生化參數較為穩定, 并且培養簡單, 擴增速度快, 常用作種質保存的材料[2,3]。同時, 絲狀體也是重要的種質材料, 其生長特性與抗逆性能決定了紫菜絲狀體育苗工作的成敗與效益。因此, 在絲狀體階段通過室內條件的控制來開展品種/品系的生化指標的對比研究, 不僅能準確反映出這些參數的差異, 開展性狀的關聯, 還有利于縮短育種過程, 提高育種效率。

生化參數是體現生物性狀的內在指標。光合色素通過影響藻類的光合效率, 影響到藻類的生長[4], 與高產特性密切相關; 紅藻糖苷是紅藻重要的滲透壓調節物和碳同化前體物質[5], 在抗逆性能和同化作用中具有重要意義; 類菌胞素氨基酸(MAAs)在紅藻中起到減少紫外輻射傷害的作用[6],與紅藻糖苷一起關系到紫菜的耐高溫和干出等逆境適應; 而激素則是藻類生長發育和抗病抗逆的關鍵調節物質[7]。這些物質是否可以作為種質評價的標準運用到育種選育評估當中, 值得深入探討。

本研究對閔豐1號(MF1)、閔豐2號(MF2)、申福2號(SF2)、浙東1號(ZD1)和浙東2號(ZD2)幾個品種/品系的壇紫菜自由絲狀體的光合色素、光合生長參數及與抗逆、生長有關的幾種關鍵代謝物進行對比分析, 以評估各品種/品系之間的生產性能與這些參數間的關系, 為紫菜新品種選育的生化評價體系的提出提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜絲狀體ZD1和ZD2來自浙江省海洋生物工程實驗室; SF2由上海海洋大學嚴興洪教授贈送;MF1和MF2由集美大學謝潮添教授贈送; 激素標準品, 美國Sigma Aldrich公司。

以添加適量的Ⅲ號營養母液(990 nmol/L KNO3,57 nmol/L K2HPO4, 9 nmol/L FeSO4·7H2O, 54 nmol/L Na2EDTA, 1 nmol/L MnSO4·H2O)的滅菌海水作為自由絲狀體的培養液, 在(20±0.5) ℃, 20 μmol/(m2·s)的光照強度, 25‰的鹽度, 在光照周期12L﹕12D的條件下搖床培養(轉速200 r/min)。待生長密度達到0.8 g/L時收集, 進行指標檢測。

1.2 儀器與設備

全波長掃描多功能酶標儀, 上海ThermoFisher公司; 液相氧電極, 英國Hansatech公司; 冷凍干燥機(美國LABCONCO公司); TSQ Quantum Access液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析系統, 美國Thermo Fisher Scientific公司; Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體光合色素的檢測

參照Wellburn等[8]的方法提取并測到不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中的葉綠素a(Chl.a)和類胡蘿卜素(Car)含量。以酶標儀測定樣品浸提液在750、665、652、510和480 nm處的吸光值, 以100%甲醇作為空白對照。根據公式計算Chl.a和Car的含量:

式中,A750、A665、A652、A510和A480表示樣品在各波長下的吸光值,V為提取液的體積(mL), FW為絲狀體鮮重(g)。

參照Hemlata等[9]的方法測定不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中藻紅蛋白(PE)和藻藍蛋白(PC)的含量。測定樣品上清液在455、564、592、618和645 nm處吸光值, 以磷酸緩沖液作為空白對照。PE和PC含量的計算公式如下:

式中,A455、A564、A592、A618和A645表示樣品在各波長下的吸光值。

1.4 壇紫菜絲狀體凈光合放氧速率檢測

利用液相氧電極對樣品進行凈光合放氧速率的測定, LED燈提供光源, 光照強度為20 μmol/(m2·s)。稱取絲狀體鮮重約10 mg, 放入2 mL的新鮮培養液中, 培養溫度20℃。方法見參考文獻[10], 通過計算獲得絲狀體的凈光合放氧速率。

1.5 壇紫菜絲狀體生長曲線檢測

將不同品種/品系絲狀體放在100 mL錐形瓶中培養, 每隔5天將絲狀體濾出, 稱取絲狀體的濕重, 記為Wt, 計算不同品種/品系壇紫菜絲狀體的相對生長速率(Relative growth rate,RGR, %/d)。RGR的計算公式為:

式中,W0表示初始重量(mg),t表示培養時間(d)。

1.6 壇紫菜絲狀體紅藻糖苷含量檢測

取各品種/品系絲狀體鮮重100 mg, 具體操作參照賴曉娟[11]的方法。根據不同濃度的紅藻糖苷和異紅藻糖苷繪制標準曲線, 計算含量。

1.7 壇紫菜絲狀體MAAs含量檢測

取各品種/品系絲狀體凍干樣品200 mg, 具體操作方法參照文獻[12]。以MAAs標準品繪制標準曲線, 并計算各樣品中MAAs含量。

1.8 壇紫菜絲狀體激素含量檢測

取各品種/品系絲狀體凍干樣品1 g, 液氮研磨,以10 mL甲醇﹕水﹕甲酸(V﹕V﹕V=15﹕4﹕1)溶液超聲浸提10 min, 再于-20℃避光提取16h。上清液旋蒸并凍干, 以甲醇復溶, LC-MS檢測參照宋悅等[10]的方法。根據不同濃度激素標準品繪制標準曲線, 并計算樣品中植物激素含量。

1.9 數據分析

采用Pearson相關性分析各品種/品系絲狀體間相對生長速率與光合色素、凈光合放氧速率、紅藻糖苷及激素的相關性。

每個實驗設3個平行(n=3), 采用SPSS 23.0軟件的最小顯著性差異法進行單因素方差分析, 差異顯著水平設置為P＜0.05, 數據以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的光合色素

在不同品種/品系的壇紫菜絲狀體中, 光合色素的含量皆以藻紅蛋白和藻藍蛋白為主(表 1)。對比5種絲狀體發現, ZD2及MF1的藻紅蛋白含量較為豐富, 均高于6 mg/g, 而ZD1和MF2中的含量則均低于4 mg/g。對比藻藍蛋白含量, MF2中的含量僅為0.63 mg/g, 而其余4種絲狀體中的藻藍蛋白含量均高于1 mg/g, 且以MF1含量最高。在5種絲狀體中, ZD2的葉綠素a含量最高, 但類胡蘿卜素含量最低; ZD1和MF2中的葉綠素a含量較低但類胡蘿卜素較高。

表1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體光合色素含量Tab. 1 The photosynthetic pigments contents of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis (n=3)

2.2 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的凈光合放氧速率

對壇紫菜絲狀體中的凈光合放氧速率進行檢測, 發現不同品種/品系絲狀體之間差異較大(圖 1)。其中ZD2的凈光合放氧速率相對其他品種/品系顯著較高(P＜0.05), 達到30.96 μmol O2/(g·h), ZD1和SF2相比ZD2顯著較低(P＜0.05), MF1和SF2之間差異不顯著(P＞0.05), 但MF2的凈光合放氧速率和其余4種絲狀體中相比, 顯著較低(P＜0.05), 只有23.07 μmol O2/(g·h)。由此可知, ZD1和ZD2尤其是ZD2的凈光合放氧能力較強, MF2最弱。

圖1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體凈光合放氧速率測定Fig. 1 The net photosynthetic oxygen release rate in conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的生長曲線

在最適生長條件下對5種壇紫菜絲狀體進行培養, 不同時間取樣檢測其生長情況。圖 2顯示, ZD2和SF2的增長較為迅速, 相對生長速率分別達到0.93和0.81%/d, 最終重量是初始值的1.37倍和1.42倍。ZD2的相對生長速率顯著高于其他幾種(P＜0.05),SF2、MF1及MF2絲狀體之間差異不顯著(P＞0.05),ZD1相對生長速率為0.69%/d, 重量只是初始值的1.3倍, 為5種絲狀體中最低。由此可知, 生長方面ZD2和SF2較占優勢, ZD1的生長最為緩慢。

圖2 不同品種/品系壇紫菜絲狀體生長曲線及相對生長速率Fig. 2 Growth curves and relative growth rates of conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.4 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中紅藻糖苷含量差異

5個品種/品系絲狀體的紅藻糖苷含量差異較為明顯(圖 3)。在5個品種/品系中, ZD1和ZD2的總紅藻糖苷含量較高, 分別為5.23 mg/g FW和5.82 mg/g。ZD1、ZD2和SF2中以異紅藻糖苷含量為主, 且ZD2中的異紅藻糖苷含量顯著較高(P＜0.05), 為5.38 mg/g含量極低。MF1和MF2中以紅藻糖苷為主, 明顯高于另外3種絲狀體(P＜0.05), 但異紅藻糖苷含量極低。其中MF2的紅藻糖苷顯著高于MF1, 達到2.43 mg/g(P＜0.05)。SF2絲狀體紅藻糖苷含量僅0.31 mg/g。

圖3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中紅藻糖苷含量Fig. 3 The content of floridosides in conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.5 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中MAAs含量差異

從圖 4可知, MF2絲狀體中Shinorine和Porphyra-334的含量顯著高于另外4個品種/品系, 分別為4.27 μg/g DW(干重)和18.67 μg/g(P＜0.05)。對比Shinorine含量, 可以看出ZD1和ZD2中含量顯著低于其余3種(P＜0.05), ZD2和SF2的差異不顯著(P＞0.05), MF1含量相對其余3種絲狀體略高(P＜0.05)。對比Porphyra-334含量, 只有MF2中的含量顯著較高(P＜0.05), 其余4種則無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體MAAs含量Fig. 4 The content of MAAs of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis

2.6 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的激素含量差異

在5種絲狀體中只檢測到異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷和蕓苔素內酯四種激素,且以反式玉米素核苷及蕓苔素內酯含量最為豐富,其余2種激素含量均小于1 ng/g DW(表 2)。MF1和MF2中的反式玉米素核苷含量顯著低于其余3種絲狀體(P＜0.05), 而ZD2中含量最豐富, 為662.52 ng/g。在5種絲狀體中只有SF2的蕓苔素內酯含量低于100 ng/g, 其次是ZD2和ZD1, 而MF1和MF2中的含量顯著高于其余3種(P＜0.05), 分別達到2325.09和6927.66 ng/g?？梢钥闯? ZD和SF的壇紫菜絲狀體含有的反式玉米素核苷較多, 蕓苔素內酯較少, 并且ZD的異戊烯腺嘌呤含量相對較少, 而MF含有的主要是蕓苔素內酯。

表2 不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中植物激素含量Tab. 2 The content of plant hormones of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis

2.7 不同品種/品系壇紫菜絲狀體生理指標的相關性

對5個品種/品系絲狀體部分生理指標進行相關性分析, 由圖 5可見, 色素中的藻膽蛋白和葉綠素a與凈光合放氧速率呈低至中度正相關(相關系數r為0.44—0.61,P＜0.01), 藻紅蛋白與相對生長速率呈中度正相關(r=0.66,P＜0.01), 葉綠素a與相對生長速率高度正相關(r=0.98,P＜0.01), 然而, 類胡蘿卜素與光合放氧速率及相對生長速率不呈正相關關系(r=-0.41和-0.97,P＜0.01); 此外, 壇紫菜絲狀體的凈光合放氧速率與相對生長速率也呈中度正相關(r=0.54,P＜0.01)。紅藻糖苷和異紅藻糖苷與相對生長速率均無明顯相關性(r=-0.16和0.26,P＞0.05), 4種檢出的激素中只有反式玉米素核苷與相對生長速率呈中度相關(r=0.55,P＜0.01), 其余3種激素均無顯著的正相關性。綜上, 除了類胡蘿卜素外的3種色素, 尤其是葉綠素a, 是影響相對生長速率的關鍵, 個別激素則存在一定的相關性, 而紅藻糖苷與生長速率基本不存在相關性。

圖5 壇紫菜絲狀體不同品種/品系間生理指標相關性分析Fig. 5 Correlation analysis of physiological indexes among conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

3 討論

壇紫菜的種質評價多以產量、抗逆、表型及營養成分指標為主。比如SF2表現出明顯的耐高溫、生長快和成熟晚等特性; MF1和MF2具有耐高溫和高產特性; 而ZD1則有葉片厚、產量高和殼孢子放散量高的特性等[13—15]。但這些指標偏重于生產性狀的描述, 影響它們內在關聯的生化指標并不明確。有文獻指出, 光合色素與藻類的生長密切相關[16]; 紅藻糖苷和MAAs是紅藻耐高溫和抗紫外的重要物質[17,18]; 而激素對植物的生長發育和抗逆關系密切[19,20]。因此, 這些指標是否可以用于表征品種/品系間的差異, 需要通過對性狀明確的品種/品系進行比較來獲取信息。

3.1 色素含量對壇紫菜生長的影響

壇紫菜生長及高產的特性與色素的含量和組成有關。藻膽蛋白是紅藻中的重要捕光色素, 對短波長的藍、綠光有較強吸收[21]。在本研究中, 壇紫菜絲狀體中藻膽蛋白含量高于葉綠素a, 相關性分析顯示出藻膽蛋白和葉綠素a與凈光合放氧速率和相對生長速率顯著相關, 而凈光合速率也與相對生長速率正相關, 證實藻膽蛋白和葉綠素a的含量與絲狀體的生長密切相關。這與鐘晨輝等[4]和李映霞等[22]研究發現的絲狀體光合效率受葉綠素a決定,并受藻膽蛋白影響的結論相符合。對比5個品種/品系絲狀體中, ZD2、SF2和MF1的藻紅蛋白含量均高于另外2個品種, 且葉綠素a在這3種絲狀體中的含量也較高, 這有利于它們捕獲光能用于光合作用。而ZD2、SF2和MF1相對其他2個品種的相對生長速率也更高。這表明, 同SF2和MF1這2個高產品種[1,14,15,23], 壇紫菜ZD2在絲狀體階段具有明顯的生長優勢。

3.2 紅藻糖苷和MAAs在壇紫菜抵御逆境中的影響

紅藻糖苷是大部分紅藻的碳同化前體物質, 主要調節機體的滲透壓、抗氧化及作為細胞壁多糖的合成前體起作用, 并且可以修復因高溫受損的細胞壁, 紅藻糖苷的合成和積累對壇紫菜應對高溫脅迫產生的氧化損傷具有重要意義[5]。在紫菜中, 紅藻糖苷由同分異構體紅藻糖苷和異紅藻糖苷組成,ZD1、ZD2和SF2壇紫菜絲狀體中以異紅藻糖苷居多, 而在MF1和MF2中以紅藻糖苷含量居多。已有研究表明, 紅藻糖苷及異紅藻糖苷均能有效清除自由基, 且紅藻糖苷的清除效率更高, 并且在遭受脅迫時紅藻糖苷在代謝上比異紅藻糖苷更為活躍[24],這使得壇紫菜在應對熱脅迫時能更快作出響應來適應高溫, MF品種含有更豐富的紅藻糖苷, 說明其對熱環境的耐受力更強。MAAs在紅藻中起到吸收紫外線, 減少紫外輻射的作用[6]。在壇紫菜中以Porphyra-334和Shinorine兩種形式為主。研究發現, 除了MF1是以Shinorine為主, 其余幾種都以Porphyra-334為主, 而MF2的MAAs含量高于其他品種/品系。結合紅藻糖苷的含量差異, 推測MAAS與紅藻糖苷可能共同參與了壇紫菜的干出和高溫的應激及耐受反應。而MF作為耐高溫和抗紫外輻射的福建品種, 可能與這2個指標的高水平有關。

3.3 激素在壇紫菜生長發育中的影響

在壇紫菜絲狀體中只檢測到異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷和蕓苔素內酯4種植物激素, 而在葉狀體中可測到吲哚乙酸、水楊酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯、反式玉米素核苷、異戊烯腺苷和異戊烯腺苷7種植物激素[10]。異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷和反式玉米素核苷都屬于細胞分裂素, 在植物中是促進細胞分裂的激素, 參與植物的生長發育[25]。蕓苔素內酯是植物內源生長激素,具有促進細胞的分裂和伸長, 提高植物的生長、產量等作用[26]。絲狀體中缺乏水楊酸、茉莉酸等與抗逆、抗病害相關的激素, 說明絲狀體的生長環境相對穩定, 主要需要調節生長和發育相關的激素。5個壇紫菜品種/品系的絲狀體中4種激素含量各有差異, 反式玉米素核苷與生長有一定相關性, 在ZD2和SF2中含量較高, 而MF1和MF2的蕓苔素內酯顯著高于其他品種/品系, 由于幾個品種/品系的選育都有高產的特性, 所以激素與生長的關系尚不明確。

4 總結

通過對比5個品種/品系的壇紫菜自由絲狀體的光合色素、凈光合放氧速率和相對生長速率, 以及幾種關鍵的抗逆相關化合物, 發現光合色素中的藻紅蛋白和葉綠素a與生長性狀呈正相關性, 可以作為高產性狀的評價指標, 其中含藻紅蛋白豐富的品種/品系能更有效地捕捉深水中的藍、綠光, 更適合深池培養; 而葉綠素a含量高的品種可以有效地捕捉紅光, 適合淺池培養。紅藻糖苷和MAAs與壇紫菜的耐高溫和干出時的抗紫外能力有關, 因此這2種物質含量較高的品種/品系適合于較高溫的南方水域或淺池培養。蕓苔素內酯和反式玉米素核苷可能都具有調節生長的作用, 需進一步研究?？傊? 本研究為新品種絲狀體的優選和人工培育提出了選育生化指標的可行性。