fbxo32基因在traf6缺失斑馬魚肝臟中的表達分析

吳士培 歐 密 李凱彬 許巧情 徐紅艷,3*

(1. 長江大學動物科學學院, 荊州 434025; 2. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380; 3. 西南大學水產學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715)

Fbox32(也被稱為atrogin-1或MAFbx)是F-box蛋白家族的一員, 而F-box蛋白家族是SCF泛素蛋白連接酶復合物中的一類亞單位蛋白, 它能夠特異性地識別磷酸化的底物, 而不同的F-box蛋白可以相應地識別不同的磷酸化底物[1]。許多研究表明,Fbox32在各種原因引起的肌肉萎縮中起著關鍵的作用。如有研究發現, 在禁食導致的小鼠(Mus musculus)肌肉萎縮過程中,fbxo32基因在小鼠骨骼肌中的表達量上調超過9倍[2]。在小鼠肌小管中,fbxo32基因的大量表達導致肌小管出現萎縮現象, 而當敲除小鼠的fbxo32基因后,fbxo32-/-基因型小鼠肌肉萎縮的癥狀相比野生型小鼠明顯減輕[3]。更有進一步的研究發現, 轉錄因子Foxo可以通過誘導fbxo32的表達使小鼠肌肉發生萎縮, 而IGF-PI3K-AKT信號通路則能通過使轉錄因子Foxo失活來抑制fbxo32的表達[4]。此外,fbxo32和endophilin-A之間的相互作用有助于維持泛素蛋白酶系統的穩定和神經元的健康[5]。在雞(Gallus gallus)中,fbxo32的高表達會加快肌肉蛋白的降解速率[6]。同樣, 有研究表明在禁食的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)中,fbxo32的高表達可能與魚體骨骼肌和平滑肌的萎縮相關[7]。在斑馬魚(Danio rerio)中,fbxo32的缺失會導致心肌發育及心臟功能異常[8]。

值得關注的是, 本研究組最近研究發現traf6基因的缺失能引起肝臟組織基因轉錄本表達譜的改變, 特別是fbxo32轉錄本的表達水平的變化尤為顯著, 其在traf6基因突變體斑馬魚肝臟中的表達異常增加近100倍(與野生型相比)。為了進一步研究斑馬魚fbxo32生理功能, 我們進行了斑馬魚肝臟組織學分析;fbxo32轉錄本組織特異性分析, 進一步比較分析了fbxo32轉錄本在traf6突變體與野生型斑馬魚的相關組織中的差異表達。特別是通過冰凍切片原位雜交技術, 深入分析了fbxo32轉錄本在traf6突變體與野生型斑馬魚肝臟組織的細胞定位及差異表達。本研究結果進一步利用斑馬魚這一優異的人類疾病研究模式生物[9,10], 為探討相關疾病特別是肝萎縮的病理機制提供了新的線索及靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用野生型斑馬魚(traf6+/+)和純合型traf6突變體斑馬魚(traf6-/-)均來自中國水產科學研究院珠江水產研究所,traf6-/-斑馬魚是由本所研究團隊通過CRISPR/Cas9基因敲除技術獲得, 該突變體為traf6第二外顯子發生蛋白編碼移框突變, 導致Traf6蛋白缺失(未發表數據)。

1.2 cDNA的制備

本研究提取的野生型斑馬魚體組織包括: 腦、肝臟、脾臟、腎臟、精巢、卵巢、肌肉和腸。提取的純合型斑馬魚體組織包括: 腦、肝臟、脾臟、腎臟和精巢。各個組織的總RNA是根據說明書, 用TRIzol法提取得到的, 提取的各組織總RNA均用DNaseⅠ處理。然后用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒并按照試劑盒附帶的說明書將RNA反轉錄獲得相應的cDNA。

1.3 肝臟組織學分析

2月齡野生型和純合型斑馬魚各取1尾, 對斑馬魚進行麻醉后, 在4℃下固定于4% PFA(Paraformaldehyde, PFA)中, 固定48h。在固定完成后對斑馬魚樣品進行脫水、滲透和石蠟包埋處理, 然后用病理切片機(RM2016, Leica)將包埋好的樣品切片, 切片厚度為1 μm。最后將組織切片進行HE(Ehematoxylin and eosin)染色, 染色后的切片將用于常規組織學檢查。

1.4 fbxo32基因在斑馬魚各個組織中表達分析

用熒光定量qRT-PCR法, 以EF1α為內參基因,檢測斑馬魚fbxo32基因在不同組織中的相對表達情況。qRT-PCR所用的試劑盒為iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix, 進行qRT-PCR反應的儀器為StepOnePlus。PCR反應條件為: 95℃ 2 min; 95℃15s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 40個循環; 95℃ 15s, 60℃1min, 95℃ 15s。用2-ΔΔCt法將對應的結果與對照組結果進行比較得出相對表達量[18]。計算數據分別來自3個重復組。引物序列如表 1所示。

表1 引物序列Tab. 1 Primers list

1.5 冰凍切片原位雜交

原位雜交中合成探針所用的引物TZ-fbxo32-F和TZ-fbxo32-R的序列如表 1所示。用引物通過PCR反應合成帶有SP6啟動子和T7啟動子的DNA,將所得DNA純化, 再以經過純化后DNA為模板, 用DIG RNA Labeling Kit試劑盒分別合成帶地高辛(Digoxigenin)標記的反義RNA探針和正義RNA探針。成魚肝臟組織: 各取1條野生型成魚和純合型成魚的肝臟組織, 再經過4%PFA固定12—18h, 用不同濃度(25%、50%、75%和100%)的甲醇溶液(用DEPC水處理過的PBS配制)梯度脫水, 最后組織置于100%甲醇保存于-20℃備用。切片前將保存的肝臟組織取出用不同濃度甲醇梯度復水, 然后置于30%蔗糖在-4℃滲透過夜。在切片時, 用OCT包埋組織后進行冰凍切片, 切片厚度為4 μm。在切片準備完畢后, 用帶地高辛標記的RNA探針進行原位雜交。具體原位雜交步驟參考之前研究采用的方法[11]。

1.6 統計學處理

熒光定量結果使用Prism 6軟件處理并作圖, 結果表示為平均值±SEM。用SPSS 20.0軟件中的T檢驗進行差異顯著性分析,P＜0.05表示差異顯著并用*標記,P＜0.01表示差異極顯著用**標記。

2 結果

2.1 traf6突變體肝臟組織發生病變

通過斑馬魚肝臟組織的石蠟切片及蘇木精伊紅染色組織學比較分析, 發現traf6突變體肝臟組織發生了明顯的病理變化, 具體表現為肝臟組織結構松散零亂, 肝細胞脂肪滴稀少; 相反, 野生型肝臟組織中肝臟細胞胞體大, 排列規則, 其脂肪滴多且明顯(圖 1)。

圖1 traf6缺失斑馬魚肝臟組織結構異常Fig. 1 traf6 deficiency causes the abnormality of liver

2.2 斑馬魚基因的組織表達

本實驗通過qRT-PCR技術分析了斑馬魚fbxo32基因在野生型斑馬魚體組織(包括肝臟、肌肉、腦、脾臟、腎臟、精巢、卵巢和腸道)的組織特異性表達分析。結果顯示, 在野生型斑馬魚中,fbxo32在各個組織中都有表達, 其中在肝臟中表達量最低,在肌肉等組織中的表達量比較高(圖 2)。進而, 我們比較分析了fbxo32在野生型和traf6突變體斑馬魚的肝臟和腎臟等組織中的差異表達, 結果發現fbxo32在traf6突變體斑馬魚肝臟的表達量相對其他組織來說是最高的, 并與野生型斑馬魚肝臟相比增加了近100倍(圖 3)。結果暗示了traf6基因的缺失會誘導fbxo32在斑馬魚肝臟中的異常高表達。

圖2 fbxo32轉錄本在野生型斑馬魚各組織中的表達Fig. 2 The expression of fbxo32 mRNA in different tissues of wildtype zebrafish

圖3 fbxo32轉錄本在野生型和traf6突變體斑馬魚相關組織中的表達差異Fig. 3 The differential expression of fbxo32 mRNA in different tissues between wild type and traf6 mutant zebrafish

2.3 fbxo32基因在肝臟組織中的表達

為了進一步分析fbxo32 mRNA在斑馬魚肝臟組織中的表達變化及細胞定位, 我們進行了traf6突變體及野生型斑馬魚肝臟組織的冰凍切片及fbxo32 mRNA的原位雜交分析。結果表明在traf6突變體肝臟組織中,fbxo32 mRNA雜交信號明顯比野生型肝臟組織的強(圖 4)。進一步結合PI染色結果分析,發現無論在traf6突變體肝臟組織還是在野生型斑馬魚肝臟組織中,fbxo32 mRNA雜交信號均特異分布在肝臟細胞中(細胞核比較圓), 而在肝臟組織中的其他細胞, 比如血細胞(細胞核長呈梭型)中就難以檢測到雜交信號(圖 5)。

圖4 fbxo32轉錄本在肝臟組織中的表達水平Fig. 4 The expression level of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissue

圖5 fbxo32轉錄本在斑馬魚肝臟組織中的細胞定位Fig. 5 The cellular distribution of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissues

3 討論

本研究通過熒光定量技術分析了fbxo32基因在斑馬魚不同組織中的表達情況, 結果顯示,fbxo32在不同組織中都有廣泛的表達, 在肌肉和卵巢組織中的表達量最高, 其次是脾臟和腦等組織。這一結果與其他物種中的fbxo32基因表達譜非常相似。比如在哺乳動物中,fbox32主要在心肌和骨骼肌細胞中表達[3], 在虹鱒[7]和大西洋鮭Salmo salar[12]中,fbxo32也是在各種組織中廣泛表達, 并且相對而言,在肌肉中表達量較高。另外, 有研究報道fbxo32在卵巢癌和食管鱗狀細胞癌中發生了表觀遺傳學沉默, 而重啟fbxo32的表達則可以抑制卵巢癌細胞的增殖[13,14], 這暗示著fbxo32基因不僅在哺乳類和魚類的肌肉和心臟中起著蛋白質降解的作用[3,7,12], 在調控動物卵巢(包括斑馬魚卵巢)的蛋白降解過程中也發揮著重要的調控作用, 而這還需要更進一步的研究來驗證。

值得注意的是, 有許多文獻證明了fbxo32能夠將特定蛋白質底物呈遞給泛素分子[2,3], 并在使其失活和對其進行標記后最終通過蛋白酶體進行降解[15]。而在哺乳動物中,fbxo32的上調能夠加快與肌萎縮相關的蛋白質的分解代謝[3]。因此, 在動物中fbxo32的表達上調將會導致肌萎縮。而本研究發現, 在traf6-/-斑馬魚的肝臟中fbxo32表達量相比traf6+/+斑馬魚肝臟上調了超過100倍, 類似地, 在發生了各種萎縮癥狀的虹鱒、大西洋鮭和其他動物中也都觀察到了fbxo32表達量的上調。另外, 與野生型斑馬魚肝臟相比,traf6突變體斑馬魚肝臟也表現出了一些肝臟萎縮的癥狀, 如肝臟組織結構形態不規則和松散、肝脂肪滴缺失等。綜上所述, 我們可以得出結論: 斑馬魚traf6基因的缺失會導致fbxo32轉錄本的上調和肝臟萎縮。這個結論與在哺乳動物中的研究結果相近: 在哺乳動物中fbxo32的表達上調與骨骼肌的萎縮相關[16,17]。然而, 要探明traf6與fbxo32之間的調控機制還有待將來更深入的研究。本研究首次發現了肝萎縮中fbxo32轉錄本的上調, 這一發現有助于進一步開展對fbxo32基因的生理功能研究及闡明動物肝臟相關疾病發生的分子機制。