甲基轉移酶set9缺失的斑馬魚低氧耐受能力增強

查荒源 于光晴 陳小云 肖武漢* 劉 興*

(1. 大連海洋大學水產與生命學院, 大連 116023; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor, HIF)介導的轉錄激活調控是細胞感受氧氣變化和應答低氧脅迫的最為關鍵的信號傳導途徑[1,2]。低氧信號傳導途徑非常保守, 從線蟲到人類, 低氧信號都啟動相同或相似的同源基因的轉錄和調控, 從而調控類似的生理和生化反應[3]。HIF由HIF-α(包括HIF-1α和HIF-2α)和HIF-1β兩個亞單位組成, 每個亞單位都包含基本的bHLH-PAS (helix-loop-helix-PAS)結構域, 該結構域介導異源二聚體的形成及與DNA的結合。HIF-1β的蛋白水平穩定, 因而HIF的活性主要由HIF-α來決定[4,5]。在常氧條件下, HIF-α能夠被一類依賴于氧氣的脯氨酸羥化酶(Prolyl hydroxylase domain enzymes, PHDs, 包括PHD1, PHD2 和PHD3)所識別, 進而對HIF-α(包括HIF-1α和HIF-2α)上特定的脯氨酸殘基進行羥基化修飾, 其中,PHD2是起主要作用的脯氨酸羥化酶[6]。被羥基化修飾的HIF-α能被pVHL(Von Hippel-Lindau)識別,pVHL能夠與ElonginB、ElonginC結合形成E3泛素連接酶復合體, 介導HIF-α通過蛋白酶體降解[7]。在低氧條件下, 由于氧氣的缺乏, 使得脯氨酸羥化酶的活性受到抑制, HIF-α的羥基化修飾受到抑制, 進而導致HIF-α的蛋白酶體降解途徑受到抑制, 從而導致HIF-α的蛋白水平得以積累, 積累的HIF-α進入細胞核, 與HIF-1β形成異源二聚體, 該二聚體與下游基因啟動子上的低氧應答元件(Hypoxia response element, HRE)結合, 從而激活下游基因的表達, 發揮相應的生物學功能[1,4]。

蛋白質賴氨酸殘基上的甲基化修飾主要是由一類含有SET 保守結構域的蛋白質完成的, 目前在哺乳動物中已鑒定到50多種蛋白質可以歸入這一家族, 組蛋白甲基轉移酶SET9就是該家族的成員[8,9]。SET9可以甲基化修飾組蛋白H3上第4位的賴氨酸殘基, 也可以對多種非組蛋白進行甲基化修飾[10—12]。SET9可以甲基化修飾p53上第372位的賴氨酸殘基,從而激活p53的轉錄活性[13]。SET9可以甲基化RelA第37位的賴氨酸殘基, 在腫瘤壞死因子TNFα的刺激下增強RelA與下游基因啟動子的結合[14]; SET9也可以甲基化RelA第314和315位的賴氨酸殘基, 從而促進與下游基因啟動子結合的RelA的降解, 抑制NF-κB信號通路的激活[15]。

前期的研究工作發現SET9可以甲基化HIF-1α上第32位的賴氨酸殘基, 抑制HIF-1α與下游基因啟動子的結合, 從而抑制低氧信號通路下游基因的表達[16]。但是, SET9在體內調控低氧信號通路和在低氧脅迫中的生物學功能及其機制還并不清楚。

研究基因在體生物學功能最好的手段是建立該基因敲除的動物模型。斑馬魚(Danio rerio)是重要的模式生物, 建立目的基因敲除的斑馬魚品系有助于研究該基因的在體生物學功能。前期的研究工作以斑馬魚為模式生物, 建立了foxo3b、tet1及fih敲除的斑馬魚品系, 用以研究這些基因在低氧耐受中的生物學功能。foxo3b可以誘導vhl的表達, 從而促進hif-α的降解, foxo3b的敲除會導致斑馬魚低氧耐受能力的下降[17]; tet1可以穩定hif-α的蛋白水平,tet1的敲除會降低斑馬魚的低氧耐受能力[18]; fih可以抑制hif-α的轉錄激活活性, fih的敲除可以增強斑馬魚的低氧耐受能力[19]。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術, 獲得了甲基轉移酶set9敲除的斑馬魚品系, 初步分析了set9基因的敲除對斑馬魚低氧耐受能力的影響, 為研究魚類甲基轉移酶set9在低氧耐受中的生物學功能及耐低氧魚類新品種的培育提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑 DNA膠回收試劑盒購自Bioflux公司, 質粒小提試劑盒購自天根公司, 限制性內切酶、RNAiso plus購自TaKaRa, All-in-One cDNA Synthesis SuperMix kit試劑盒、SYBR Green Fast quantitative PCR master mix試劑盒購自Biotool公司, T4 DNA連接酶、DNase Ⅰ購自Fermentas公司,T7體外轉錄試劑盒購自Ambion公司, Agarose、2×Sosoo Mix重組酶購自Tsingke公司, DNA Marker、Trans10感受態細胞購自TransGen公司, 多聚甲醛、DEPC購自Amresco公司。

主要儀器 顯微注射儀PLI-100(Harvard Aparatus), 斑馬魚生化培養箱SHP-150(上海精宏),低氧工作站Invivo2(Ruskinn), 凝膠成像系統(上海培清科技有限公司), 離心機5702、5430、5425D、5415R(Eppendorf), 熒光定量PCR儀Step One Real-Time PCR System(ABI), 恒溫水浴鍋(上海精宏),Nanodrop 2000濃度定量儀(Thermo), -80℃超低溫冰箱(Thermo)。

1.2 斑馬魚品系

AB品系的斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。

1.3 序列分析

使用ClustalX2軟件對人SET9、小鼠Set9和斑馬魚set9的氨基酸序列進行比對, 并根據已知的人SET9的結構域標注3個物種的SET結構域及其甲基轉移酶的酶活性位點。

1.4 斑馬魚set9基因的敲除與鑒定

利用在線設計工具 (http://crispr.mit.edu) 設計Cas9作用的靶位點; 將體外合成的Cas9 mRNA和gRNA(guide RNA)按照400 ng/μL﹕60 ng/μL混合后,注射到一細胞期胚胎動物極; 24h后, 利用異雙鏈遷移率測定法(Heteroduplex mobility assay, HMA)篩選有敲除效果的F0代嵌合體; F0代性成熟后與AB品系斑馬魚交配, 篩選到能穩定遺傳的F1代雜合子;F1代性成熟后自交可獲得對應的野生型和純合子突變體, 利用PCR擴增基因組中包含Cas9作用靶位點的DNA片段, 經測序確定突變的堿基信息。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

取受精后3d的野生型及set9基因敲除的斑馬魚幼魚, 使用TaKaRa公司的RNAiso plus進行RNA的提取, 使用Biotool公司的All-in-One cDNA Synthesis SuperMix kit試劑盒進行cDNA的合成, 使用Biotool公司的SYBR Green Fast quantitative PCR master mix試劑盒進行qRT-PCR檢測, 使用5′-GCATGT GCTGGGTCTACTATC-3′和5′-GGCCATCAGGG TACACATAAG-3′擴增set9的mRNA,β-actin作為內參, 其擴展引物為5′-TACAATGAGCTCCGTGTT GC-3′和5′-ACATACAATGGCAGGGGTGTT-3′。

1.6 斑馬魚低氧處理

使用Ruskinn Invivo2 I-400低氧工作站進行斑馬魚的低氧脅迫處理。對于受精后3d的斑馬魚幼魚, 低氧脅迫時氧氣濃度調整到2%, 將出膜且發育程度一致的野生型及基因敲除的斑馬魚置于6 cm培養皿中, 每皿50條, 加入5 mL的胚胎培養液（Egg water）, 放置于低氧工作站中, 每12h統計1次魚的存活情況, 利用GraphPad 7.0繪制存活曲線; 對于3月齡的斑馬魚成魚, 低氧脅迫時氧氣濃度調整到5%, 將個體大小相近(個體重量±0.02 g)的野生型及基因敲除的斑馬魚放置于250 mL錐形瓶中, 加入200 mL的曝氣水, 放置于低氧工作站中, 并進行跟蹤拍照, 記錄魚的運動及存活情況。

1.7 TUNEL染色

將個體大小相近(個體重量±0.02 g)的3月齡野生型及基因敲除的斑馬魚放置于低氧工作站, 并在低氧脅迫6h后將對應的野生型及敲除品系的斑馬魚進行腦部的取材和固定, 利用TUNEL染色試劑盒進行染色并進行拍照, 比較斑馬魚腦部細胞凋亡的情況。

1.8 統計學處理

所有相關實驗至少重復3次。使用GraphPad 7.0軟件展示統計的數據, 結果表示為平均值±SEM。對于所有比對,P＜0.05被視為具有統計學意義。

2 結果

2.1 斑馬魚甲基轉移酶set9的序列特征

斑馬魚set9基因的全長CDS長度為1977 bp, 編碼373個氨基酸組成的蛋白質。利用ClustalX2軟件對人SET9、小鼠Set9和斑馬魚set9的氨基酸序列進行比對, 發現序列的保守性很高。作為一個含SET結構域的賴氨酸甲基轉移酶, 斑馬魚set9也含有一個保守的SET結構域(圖 1中虛線框標注)并且其發揮甲基轉移酶活性的酶活性位點在三個物種間都是保守的(圖 1中實線框標注)。

圖1 人SET9、小鼠Set9、斑馬魚set9的氨基酸序列對比Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of human SET9, mouse Set9 and zebrafish set9

2.2 建立set9基因敲除的斑馬魚品系

根據CRISPR/Cas9基因編輯技術的原理, 在斑馬魚set9基因的第一個外顯子上, 設計了基因編輯的靶位點, 其序列為5′-GGACAGCGATGATGAC AACA-3′(圖 2A)。提取基因編輯品系魚尾基因組,使用引物5′-AGTGCAGGGCTGATGATG-3′和引物5′-CTAATCCTCGACGGAATGAGAC-3′擴增包含靶位點的DNA片段, 經異雙鏈遷移率測定法篩選獲得有效果的F0代(圖 2B)。

F0發育至性成熟后與AB品系交配, 篩選到能穩定遺傳的F1代, 獲得一個缺失8個堿基的品系。由于在翻譯起始密碼子之后, 缺失8個堿基, 造成移碼突變, 終止密碼子提前出現, 使得突變的品系只表達不包含SET結構域的14個氨基酸的多肽(圖 2A)。由于翻譯的提前終止, 會導致mRNA的不穩定性,進而導致mRNA的快速降解, 因此, 進一步利用qRT-PCR技術分析野生型和突變品系中set9的mRNA水平, 結果顯示突變品系中set9的mRNA水平顯著下降(圖 2C)。

圖2 利用CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚set9基因Fig. 2 Targeting strategy for generating zebrafish set9 mutant by CRISPR/Cas9

以上結果表明, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術, 獲得了set9基因敲除的斑馬魚品系。在實驗室正常飼養條件下,set9基因敲除的斑馬魚與其同胞野生型相比, 發育、生長和繁殖等并無肉眼可見的差異。

2.3 set9的敲除能增強斑馬魚低氧耐受能力

利用獲得的set9基因敲除的斑馬魚品系, 分析set9基因在斑馬魚低氧耐受中的功能。首先, 選取出生后3d的斑馬魚幼魚進行低氧處理。該時期的斑馬魚幼魚剛孵化出膜, 可以方便地獲取足夠數量的樣本, 且個體差異較小, 因而可以很好地評估斑馬魚低氧耐受能力的差異。將野生型及set9基因敲除的斑馬魚幼魚放置于氧氣含量為2%的低氧工作站中, 隨著時間的推移, 記錄斑馬魚幼魚的存活時間, 制作存活曲線。結果顯示, 在低氧脅迫處理24h后, 野生型的斑馬魚已經開始死亡, 而set9基因敲除的斑馬魚在處理36h后才出現明顯的死亡; 在低氧脅迫處理60h后, 野生型的斑馬魚均已死亡, 而set9敲除的斑馬魚還有部分存活(圖 3)。由此可見,set9基因的敲除可以增強斑馬魚幼魚的低氧耐受能力。

圖3 set9基因的敲除能增強斑馬魚幼魚的低氧耐受能力Fig. 3 Deletion of set9 enhances hypoxia tolerance in zebrafish larvae

進一步, 選取3月齡的斑馬魚成魚進行低氧耐受能力的比較。將野生型及set9基因敲除的斑馬魚成魚放置于氧氣含量為5%的低氧工作站中, 錄制視頻記錄斑馬魚的存活及運動的情況。結果顯示,在低氧脅迫處理4h后, 野生型的斑馬魚即開始出現死亡; 在低氧脅迫處理8h后, 野生型的斑馬魚均已死亡, 而set9敲除的斑馬魚則剛開始有魚出現瀕死的跡象(圖 4)。以上結果顯示,set9基因的敲除可以增強斑馬魚成魚的低氧耐受能力。

圖4 set9基因的敲除能增強斑馬魚成魚的低氧耐受能力Fig. 4 Deletion of set9 enhances hypoxia tolerance in zebrafish larvae

2.4 set9的敲除減輕低氧導致的腦細胞凋亡

為闡明set9敲除的斑馬魚高低氧耐受力的機制, 利用TUNEL染色檢測低氧脅迫處理后野生型及set9敲除的斑馬魚腦中細胞凋亡的情況。5%O2處理6h后, 選擇存活的野生型及set9敲除的斑馬魚, 對其腦組織取材、固定、切片并進行TUNEL染色。結果表明, 野生型斑馬魚腦中凋亡細胞數量明顯高于突變體(圖 5)。

圖5 set9基因的敲除能減少低氧脅迫下的斑馬魚腦部的細胞凋亡Fig. 5 Deletion of set9 diminishes hypoxia-induced apoptosis in adult zebrafish brains

3 討論

SET9是一種重要的賴氨酸甲基轉移酶, SET9最開始報道為通過甲基化組蛋白H3的第4位賴氨酸殘基來實現對基因表達的調控[11]。此外, 多種非組蛋白也被發現是SET9的底物, 包括p53、TAF10、E2F1、AR、RelA和FOXO3a等[12]。SET9通過調控這些非組蛋白的甲基化修飾參與了細胞對多種環境脅迫的響應: SET9對FOXO3a的甲基化修飾可以調控氧化損傷誘導的神經細胞死亡[20,21]; SET9通過甲基化修飾p53和E2F1等轉錄因子的活性來響應DNA損傷等[13,22,23]。最近, 首次在細胞水平報道了SET9通過直接甲基化低氧信號通路中的關鍵轉錄因子HIF-1α第32位的賴氨酸殘基, 進而調控HIF-1α的轉錄活性, 從而在低氧信號轉導及細胞低氧脅迫應答中發揮重要的生物學功能[16]。然而, 對于SET9在體內的生物學功能還并不清楚。

水體溶氧量隨季節、地理位置、水流狀態和水體環境等變化而發生很大的變化, 魚類在長期演化歷程中發展出適應不同溶氧水環境的策略[3]。而另一方面, 隨著“工廠化”養殖等集約化養殖模式的發展, 單位水體養殖密度和產量的提高, 也迫切地要求養殖品種的耐低氧能力有相應的提高。對于魚類低氧適應機制的研究, 不僅對于認識魚類物種的分化及低氧信號傳導途徑的系統演化等方面具有十分重要的理論意義, 而且對于培育耐低氧魚類新品種具有十分重要的實踐意義。低氧信號傳導途徑非常保守, 近年來的研究表明其在魚類低氧適應及低氧耐受中具有重要功能[24—26]。鑒于低氧誘導因子及其調控的分子網絡在低氧信號傳導中的關鍵作用, 挖掘低氧誘導因子的調控因子并解析其調控模式的分子機制是闡明魚類低氧耐受分子機制的主要手段, 可以為培育耐低氧魚類新品種提供候選靶標。

在哺乳動物中, SET9通過甲基化HIF-1α第32位的賴氨酸殘基, 從而實現對低氧信號通路的調控。SET9在不同物種間具有極高的保守性, 其發揮甲基轉移酶活性的SET結構域和酶活性位點, 在不同物種間都是非常保守的。然而, 斑馬魚中HIF-1α第32位的賴氨酸殘基并不保守, 并不具備SET9作用的經典底物所具備的“R/K S K”3個氨基酸組成的基序[13,16]。因此, 斑馬魚set9調控低氧信號傳導途徑及影響魚類低氧耐受的分子機制還有待進一步的探討, 很可能與哺乳類SET9調控低氧信號傳導的機制有所不同。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術, 獲得了甲基轉移酶set9敲除的斑馬魚品系。斑馬魚set9基因的敲除可以增強斑馬魚的低氧耐受能力,減少低氧脅迫導致腦組織中的細胞凋亡水平, 且在正常飼養條件下, 其發育、生長和繁殖與野生型斑馬魚相比, 并無差異。本研究為深入了解甲基轉移酶set9的在體生物學功能及其機制提供了線索, 也為魚類耐低氧新品種的培育提供了候選的靶標。