黑色素瘤缺乏因子2在結直腸癌中的表達及臨床意義

陳建軍 王振軍 趙寶成 李竹林

黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)作為組成炎癥小體的一種關鍵蛋白，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。編碼AIM2的基因位于1q21，在惡性黑色素瘤中作為一種抑癌基因[1]。有研究指出，在多種實體腫瘤中AIM2的表達存在差異[2-6]。Dihlmann 等[7]通過組織芯片(TMA)技術分析了414例國外結直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織，結果顯示腫瘤組織與癌旁組織相比AIM2基因表達降低。但Liu等[8]使用QRT-PCR技術研究了40例中國病人，他們發現結直腸癌病人的腫瘤組織與癌旁組織中AIM2的表達無明顯差異。我們使用熒光定量PCR和免疫組化技術來明確結直腸癌組織中AIM2的表達水平，分析AIM2的蛋白水平與結直腸癌病人的臨床病理特征之間是否存在相關性。

對象與方法

一、對象

2015年6月～2016年6月間我院經手術治療的原發性結直腸癌病人標本，其中包括64例新鮮冰凍組織標本，68例石蠟標本。入組條件：(1)均為原發性結直腸癌病人；(2)術前未接受放、化療及其他新輔助治療；(3)具有完整的臨床病理結果；(4)標本采集均通過首都醫科大學附屬北京朝陽醫院倫理委員會鑒定同意。分別留取病人腫瘤組織及距腫瘤組織3～5 cm處的癌旁組織標本。

二、方法

1.熒光定量PCR驗證AIM2的表達：新鮮冰凍樣品進行研磨裂解后，提取RNA并進行逆轉錄，采用的內參基因為GAPDH，目的基因AIM2的上游引物序列為GCAAGATATTATCGGCACAG，下游引物序列為GAGTTTGAAGCGTGTTGATC，熒光定量PCR的結果采用相對定量法2-ΔΔCt進行分析。

2.免疫組化：將固定后的組織石蠟包埋、4 μm厚連續切片，經過抗原修復、清除內源性過氧化物酶、血清封閉后，采用1∶500濃度的Anti-AIM2抗體進行一抗孵育，后滴加酶標抗鼠/兔聚合物，并通過DAB顯色及復染后完成免疫組織化學染色。使用免疫反應評分(imunoreactivity sore,IRS)來進行半定量分析AIM2蛋白的表達水平。AIM2免疫組化陽性信號定位于細胞漿和/或細胞核著色呈棕黃色。著色細胞數評分按AIM2陽性細胞百分率計算，陽性細胞1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，81%～100%記為4分。表達強度則以陰性記為0分，弱陽性記為1分，陽性記為2分，強陽性記為3分，著色細胞數得分乘以著色強度得分為最終得分。隨機選擇5個高倍鏡(×400)視野進行計數，每個視野計數 100個細胞。

三、統計學方法

應用SPSS 19.0軟件分析數據。結直腸癌組織及其癌旁組織AIM2的mRNA水平的相對表達的差異采用配對樣本t檢驗；蛋白水平的差異采用t檢驗；AIM2免疫染色評分水平與其他臨床病理因素的相關性分析及其他計數資料用多因素方差分析。P<0.05為差異具統計學意義。

結果

熒光定量PCR提示結直腸癌腫瘤組織中AIM2的mRNA水平降低。熒光定量PCR結果顯示，在64例腫瘤組織標本中，AIM2相對表達水平2-ΔΔCt為0.65±0.62，而癌旁組織的2-ΔΔCt為3.19±3.13。結直腸癌腫瘤組織中AIM2的mRNA表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 結直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中AIM2表達水平比較(aP<0.05)

68例石蠟標本的免疫組化的結果顯示，AIM2蛋白在結直腸癌腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織。AIM2蛋白主要位于細胞質中，陽性染色為棕黃色或褐色(圖2)。綜合考慮免疫反應評分及染色陽性率來判定AIM2的表達情況，68例結直腸癌組織中，免疫反應評分為4.53±3.43，染色陽性表達率為75.00%(51/68)；癌旁組織的免疫反應評分為7.76±3.38，染色陽性表達率為95.59%(65/68)，免疫反應評分及染色陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。免疫組化結果提示，結直腸癌腫瘤組織中的AIM2蛋白表達水平要低于癌旁組織，這與熒光定量PCR的結果相符合。

A：AIM2陽性表達(HE，×200)；B：AIM2陰性表達(HE，×200)

研究的臨床指標包括病人的年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、T分期、淋巴結轉移、遠處 轉移及TNM分期。結果顯示，AIM2的蛋白水平與結直腸癌的分化程度顯著相關(P<0.05)，即腫瘤分化越差時AIM2蛋白的表達水平越低，而與其他臨床指標未見明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1 結直腸癌組織中AIM2的蛋白水平與各臨床病理特征的關系

討論

結直腸癌是嚴重危害人類健康的常見消化系統惡性腫瘤，2020年美國有147 950例新發病例，在男性和女性腫瘤中均排在第3位[9]。有數據顯示，在中國人群中，結直腸癌的發病率及死亡率也處于較高水平[10]。由于病人的早期癥狀不明顯，沒有早期診斷的特異性標志物，很多病人確診時已發生局部或遠處轉移，結直腸癌治療后5年生存率為50%～60%。尋找合適的標志物，有助于早期發現結直腸癌并明確高風險的病人。

AIM2是一種潛在的腫瘤標志物，在多種腫瘤組織中存在表達異常。AIM2蛋白屬于干擾素誘導的PYHIN蛋白家族(或稱為p200蛋白家族)的一員[11],作為固有免疫中的一個重要組成部分，AIM2在多種細胞中存在表達，在多種皮膚疾病的角質細胞中可觀察到固有免疫細胞中外源性雙鏈DNA通過AIM2激活炎性小體[12]。除了固有免疫細胞，有研究證實了血管內皮細胞和平滑肌細胞中的AIM2也可感受外源性雙鏈DNA，而在脾臟、小腸、外周血白細胞中也發現有AIM2的mRNA表達。提示在多種細胞中，AIM2是普遍的危險感應器。在腫瘤組織中，AIM2的表達會發生異常改變，研究指出在前列腺癌組織，膠質瘤組織中AIM2的表達減少[13-14]，而在皮膚鱗狀細胞癌和肺腺癌中AIM2的表達會增加[4，15]，提示在不同的腫瘤組織中，AIM2發揮的作用也存在差異。目前，國內外報道中關于AIM2在結直腸癌中的表達水平存在矛盾。

本研究通過熒光定量PCR和免疫組化技術分別檢測了64例結直腸癌病人的新鮮冰凍組織標本和68例石蠟標本及對應的癌旁組織標本，結果顯示，結直腸癌組織中的AIM2的mRNA水平和蛋白水平均低于相應的癌旁組織，此結果與Dihlmann等[7]結果相一致。

為了進一步了解AIM2與結直腸癌病人不同臨床病理特征之間是否存在聯系，我們對腫瘤組織中AIM2的蛋白水平與病人的臨床病理參數進行了分析。結果顯示，AIM2的表達水平與腫瘤的分化程度有關，腫瘤分化程度越低，AIM2蛋白水平越低。腫瘤分化程度是影響腫瘤病人生存期及預后的重要因素，因此AIM2蛋白的表達情況可能是結直腸癌重要的預后預測因子，而其相關機制仍需要進一步研究。