甜蕎根轉錄組SSR位點特征分析

石桃雄,黎瑞源,黃 娟,陳慶富,梁成剛**

(1.貴州師范大學 蕎麥產業技術研究中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州省信息與計算科學重點實驗室,貴州 貴陽 550001)

蕎麥(FagopyrmMill)屬蓼科雙子葉植物,有甜蕎(Fagopyrmesculentum)和苦蕎(Fagopyrumtartaricum)兩個栽培種。甜蕎又名普通蕎麥(Common buckwheat),主要種植在我國華北、西北和東北地區[1]。甜蕎含有豐富的蛋白質、脂肪、粗纖維、維生素、無機鹽和多種有益于人體的微量元素,且含有小麥、大米和玉米等谷類作物沒有的蘆丁和葉綠素等生物活性物質[2],因此其營養價值明顯高于谷類作物,是我國重要的糧藥兼用的雜糧作物之一。

我國甜蕎種質資源豐富,在編入“中國蕎麥品種資源目錄”的2704份蕎麥種質中,甜蕎占67.43%[3]。評價甜蕎種質資源的遺傳多樣性有利于優異基因的挖掘和新品種的培育。SSR標記具有數量多、多態性豐富、操作簡單、擴增結果穩定等優點,是目前蕎麥屬植物遺傳多樣性研究和遺傳圖譜構建最常用的分子標記[4]。隨著高通量測序技術成本的降低,前人已根據苦蕎基因組[5,6]和轉錄組[7-9]序列大規模發掘了SSR位點,并將這些位點應用于苦蕎種質資源遺傳多樣性評價[10,11]、群體結構分析[12]、遺傳圖譜構建[13]和重要農藝性狀的關聯分析[14]等研究。近年來,甜蕎參考基因組序列[15]以及籽粒[16-19]、花[20]和根[21]等組織的高通量轉錄組序列已相繼被公布,為甜蕎大規模SSR標記的開發奠定了基礎。Shi等[10]分析了甜蕎籽粒轉錄組SSRs的分布特征,從合成的150對SSR引物中篩選到36對多態性SSR引物,并比較了SSR引物在甜蕎和苦蕎中的通用性。目前已開發的甜蕎SSR標記不超過300對,遠遠不能滿足其應用于遺傳圖譜構建、數量性狀的QTL定位和關聯分析等研究。本文根據甜蕎根轉錄組高通量測序獲得了Transcripts序列,分析了SSRs的分布、重復類型、基序種類和重復次數等特征，并基于檢索到的SSRs設計全部的引物,篩選了與黃酮類物質合成相關的SSR引物。

1 材料與方法

1.1 SSRs掃描

基于甜蕎品種豐甜1號根系轉錄組高通量測序數據,利用Misa軟件在默認參數下對長度大于200 bp的Transcripts序列進行了SSR位點掃描,篩選標準為:單核苷酸重復次數≥10；二核苷酸重復次數≥6；三至六核苷酸重復次數≥5；將相距20個堿基以內的SSR位點視為復合型位點。利用Excel 2019對獲得的SSRs進行統計分析。

1.2 SSRs引物合成

根據Transcripts拼接的Unigenes序列,采用Krait v0.10.2軟件,在默認的參數下設計SSR引物。根據Unigenes注釋信息篩選與黃酮生物合成相關的結構基因的SSR引物。

2 結果與分析

2.1 甜蕎根Transcripts長度的分布和SSR位點的出現頻率

對甜蕎根轉錄組測序，共獲得了55392條長度大于200 bp的Transcripts序列,其中,長度介于201～400 bp的Transcripts數量最多,有23249條,占總數的41.97%;其次是長度>1000 bp的Transcripts,有15647條,占總數的28.25%。含有SSR位點的Transcripts共3906條,SSR的分布頻率為7.54%。隨著Transcripts序列長度的增加,SSR的分布頻率和出現頻率均增高,平均每1.709 kb出現1個SSR位點(表1)。

表1 甜蕎根轉錄組SSR位點數量及頻率

2.2 甜蕎根轉錄組SSRs分布和重復類型

對SSRs重復類型的統計分析結果顯示：在3906個SSRs中,2133個(占54.61%)分布在長度>1000 bp的Transcripts序列中；688個(17.61%)分布在長度介于201～400 bp的Transcripts序列中；在長度介于401～600、601～800和801～1000 bp的Transcripts序列中分別含有400個(占10.24%)、366個(9.37%)和319個(8.17%)SSRs。

在3906個SSRs中,單核苷酸重復類型數量最多,為1880個,占總數的48.13%;其次是三核苷酸重復類型,為1253個,占總數的32.07%;第三是二核苷酸重復類型,為609個,占總數的15.59%;四至六核苷酸重復類型數量很少,總共64個,占總數的1.63%;另外有100個位點是復合型,占總數的2.56%(表2)。

表2 甜蕎根轉錄組SSRs的重復類型、數量(比例/%)與分布特征

2.3 甜蕎根轉錄組SSRs單至三核苷酸重復的基序類型和分布

由于單、二和三核苷酸重復類型占SSRs總數的95.80%,因此針對這3個類型進行了SSR基序類型、數量與分布特征的統計分析。表3顯示：在1880個單核苷酸重復類型中，有(A)n和(T)n兩種基序,其中(A)n占絕對優勢,共有1856個,占單核苷酸重復類型總數的98.72%,占總SSRs的47.52%；在609個二核苷酸重復類型中，有(AC)n、(AG)n和(AT)n三種基序,其中(AG)n和(AT)n數量較多,分別有299和268個,分別占二核苷酸重復類型總數的49.10%和44.17%,分別占總SSRs的7.65%和6.86%；在1253個三核苷酸重復類型中，有(AAC)n、(AAG)n、(AAT)n、(ACC)n、(ACG)n、(ACT)n、(AGC)n、(AGG)n、(ATC)n和(CCG)n等10種基序,其中數量較多的為(AAG)n、(ATC)n和(ACC)n這3種基序,分別有371、220和192個,分別占三核苷酸總數的29.60%、17.56%和15.32%,分別占總SSRs的9.49%、5.63%和4.91%。

表3 甜蕎根轉錄組SSRs單、二和三核苷酸重復的基序類型、數量與分布特征

2.4 甜蕎根轉錄組SSRs單至三核苷酸基序的重復次數

對單至三核苷酸類型SSR基序重復次數的統計分析結果顯示：SSRs以10次重復的頻率最高,有994個,占25.45%；其次為5次重復,有809個,占20.71%。在每個重復類型中,SSR數量均隨著基序重復次數的增加而減少。在1880個單核苷酸SSRs中,10次重復的SSRs數量最多，達960個,占單核苷酸數的51.06%和SSRs總數的24.58%;重復次數≥12的SSRs總共有516個,占單核苷酸數的27.45%和SSRs總數的13.21%。在609個二核苷酸SSRs中,6次重復的SSRs數量最多,為299個,占二核苷酸數的49.10%和SSRs總數的7.65%。在1253個三核苷酸SSRs中,5次重復的SSRs數量最多,為809個,占三核苷酸數的64.57%和SSRs總數的20.71%(表4)。

2.5 甜蕎根轉錄組SSRs引物設計

黃酮類化合物是甜蕎的主要藥用成分之一。基于1793個含有SSR位點的Unigenes序列,共成功設計了1183對SSR引物。通過篩選SSR引物源自Unigenes的功能注釋信息,共獲得了3對與黃酮生物合成途徑中關鍵結構基因相關的SSR引物(表5),可用于評價甜蕎種質資源黃酮生物合成相關基因內部序列的多態性。

表5 來自黃酮生物合成相關基因的SSR引物的信息

3 討論與結論

SSR標記根據來自序列的不同可分為兩種:基因組Genomic-SSR和表達序列表簽Genic-SSR(EST-SSR)。與Genomic-SSR相比,Genic-SSR源自保守性較高的轉錄序列,在物種間的通用性更好。Shi等[16]開發的150對甜蕎Genic-SSR引物中,32對(20.7%)在苦蕎種質中具有多態性。馬名川等[6]開發的200對苦蕎Genomic-SSR引物中,48對(24.0%)在甜蕎種質中具有多態性。為了豐富蕎麥屬植物SSR標記數量,本研究挖掘了甜蕎根轉錄組SSR位點,共獲得了3906個SSR位點,SSRs出現頻率為1/1.709 kb,接近于甜蕎的(1/1.17 kb)[16],略低于苦蕎籽粒轉錄組的SSRs出現頻率(1/1.73 kb)[9],高于苦蕎基因組(1/21.339 kb)[6]和苦蕎不同品種種皮混合轉錄組(1/7.809 kb)[7]SSRs的出現頻率。

SSRs重復類型和基序的分布與作物種類、檢索條件和序列類型等因素有關。本文檢索到的3906個SSRs中,單至三核苷酸重復類型占SSRs總數的95.80%,數量從大到小依次為單核苷酸(1880)>三核苷酸(1253)>二核苷酸(609)。不考慮單核苷酸重復,且當二、三核苷酸在相同的篩選條件下時,SSRs重復類型的分布與甜蕎籽粒[16]、苦蕎籽粒轉錄組[7-9]和苦蕎基因組[6]一致。前人的研究表明單核苷酸SSRs數量多,多態性程度較高,例如,賀潤麗等[7]開發的41對多態性Genic-SSR引物中,單核苷酸重復就有29對(70.73%),因此在開發蕎麥屬SSR標記時,對單核苷酸SSRs應予以考慮。本文單核苷酸以(A)n基序出現的頻數最高,與Shi等[16]和賀潤麗等[7]的研究結果一致;二核苷酸重復以(AG)n基序出現的頻數最高,與甜蕎[16]和苦蕎[8]籽粒轉錄組SSR的研究結果相同,但與苦蕎基因組[5,6]和種皮轉錄組[7]中以(AT)n是優勢基序的研究結果不同,說明蕎麥屬植物二核苷酸基序的分布與種屬和組織有關。三核苷酸重復以(AAG)n基序數量最多,與甜蕎[16]、苦蕎轉錄組[7-9]和苦蕎基因組[6]SSR的研究結論一致,也與雙子葉植物Genic-SSRs重復基序的分布相同,但與谷類作物Genic-SSRs以(GGC)n為優勢重復基序的研究結果[22]不一致。

本文根據搜索的全部SSR位點共成功設計了1183對SSR引物,為蕎麥屬植物種質資源多樣性評價、遺傳圖譜構建、基因定位和重要性狀基因的發掘等研究提供了豐富的SSR標記。篩選SSR位點對應的Unigenes的功能注釋信息,獲得了3對與黃酮生物合成途徑關鍵結構基因相關的SSR引物,可用于評價蕎麥屬植物種質資源黃酮代謝相關基因內部序列的多態性,可為發展與黃酮含量關聯的功能標記、分子標記輔助改良蕎麥黃酮含量提供依據。