黑麥草對土壤中抗生素的降解及其機理研究

吳玉清，王永會，李 祥，胡鴻飛，趙雨佳

（1.鴻灌環境技術有限公司，江蘇蘇州215200；2.常州大學環境與安全工程學院，江蘇常州213164）

抗生素的組成分為霉菌、細菌、其他微生物產生的次級代謝產物、人工合成的類似化合物。美國每年抗生素在畜禽養殖業中使用量約為15.9萬噸，中國每年用在畜禽養殖的抗生素大約在8萬噸以上。據Wise 2002年統計，抗生素在全球每年的用量為10～20萬噸，其中中國約占年消費量的四分之一，并且全球抗生素用量每年都在逐步增加。

目前，畜禽養殖業中各種抗生素的濫用現象十分廣泛。絕大部分抗生素不能被機體全部消化分解。據統計，約80%及以上的抗生素經畜禽的排泄物和其他分泌物或者其他途徑排出體外，通過不同途徑對水和土壤環境造成污染。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

磺胺二甲基嘧啶（SM2），純度＞98%，上海卒瑞有限公司；金霉素（CTC）、四環素（TC）、強力霉素（DC）、洛美沙星（LOM）、諾氟沙星（NOR）、恩諾沙星（ENR）、環丙沙星（CIP），純度均＞96%，阿拉丁公司。

1.2 主要實驗儀器

FAI104N電子天平；KQ-2 50E醫用超聲波清洗器；101-L電熱恒溫鼓風干燥箱；UGC-12MT氮吹儀；GM-0.3311隔膜真空泵；DZS-708型pH計；X1R高速冷凍離心機；LC-MS/MS高效液相色譜-質譜儀；SPE固相萃取裝置，質譜，三重串聯四級桿，Water TQ Detector，Waters，USA；HZQ-F160全溫振蕩培養箱；LAS植物根系分析儀；THS-82A恒溫搖床；SPX-250BSH-11生化培養箱；LDZX-50KB高壓滅菌鍋；SPX-250智能生化培養箱；-86-340型-80℃超低溫冰箱；KQS200DB數控超聲清洗器；JAHY11制冰機；DHG-9123A烘箱。

1.3 培養基的配制

氨化培養基的配制：

（1）液體培養基的配制：分別稱取氯化鈉1.2 g，葡萄糖2 g，七水合硫酸鎂0.3 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸銨1.2 g，硫酸亞鐵0.2 g，將所有藥品加入水中溶解，并加蒸餾水定容至500 mL，調節pH至7.3左右，120℃在滅菌鍋中滅菌0.5 h。

（2）蛋白胨（0.2%）的配制：取1 g蛋白胨粉末慢慢溶于水中，并加蒸餾水定容到500 mL的錐形瓶內，120℃下滅菌鍋中滅菌0.5 h。

1.4 其他試劑的配制

（1）抗生素標準液的配制

2 000μg/mL標準溶液：取100 mg抗生素加入水中，并定容到50 mL制成標準液。然后取1.25 mL標準溶液定容至25 mL，配制濃度為1μg/g；同時取6.25 mL標準溶液定容至25 mL，配制濃度為5μg/g。

（2）抗生素提取液（EDTA+甲醇）的配制

甲醇溶液的配制：準確稱取0.026 g標準樣品溶于甲醇，定容到25 mL棕色容量瓶中，配制1 mg/mL濃度的標準溶液。試驗用水均為超純水。

0.1 moL/L鹽酸溶液的配制：量取8.6 mL濃鹽酸加入水中，并定容到1 L。

1.5 土壤樣品前處理

實驗污染土壤采自常州風干水稻田，過20目篩，研磨，備用。

1.6 抗生素污染土壤配置及盆栽試驗

1.6.1 污染土壤配置

土壤樣品和豬糞按100∶1混勻，過20目篩，備用。

1.6.2 黑麥草的種植和培育

取3盆實驗空白土樣不種植黑麥草，作為對照組。每種抗生素取3盆種植黑麥草，種子發芽之后測定不同時段土壤中殘留抗生素的量。

1.7 土壤中抗生素的提取

1.7.1 提取液的選擇

抗生素的提取液組成成分為EDTA和甲醇溶液，抗生素提取液比例為：EDTA緩沖溶液∶甲醇=1∶1（V/V）。

1.7.2 抗生素的提取

稱取5.1 g土壤樣品放到離心管中，然后加入配制好的抗生素提取液（比例為1∶1，pH=4）10 mL，振蕩1 min左右確保樣品充分混勻，超聲萃取10 min后，5 000 r/min下離心分離6 min提取上清液。分別再加入8 mL、6 mL抗生素提取液到離心管中，按上述步驟提取兩次。將收集的濾液過濾膜后用超純水稀釋到400 mL。分別用2 mL的超純水和甲醇沖洗并活化幾次，然后將濾液流過HLB固相萃取柱富集。上樣完畢后，用5%的甲醇水溶液清洗萃取柱，然后干燥10 min。之后用離心管收集洗脫液，并氮吹使液體少于0.5 mL。將接近干的洗脫液加入甲醇定量至2 mL，加入20μL、100 μL/L的西瑪通，充分搖勻后作為內標物（對比測定含量）。最后將其過0.25μm濾膜，轉至棕色小瓶中，4℃下避光保存待測。

2 黑麥草對典型抗生素的降解效果

2.1 黑麥草對土壤中四環素類和磺胺類抗生素的降解

液相色譜-質譜（LC-MS/MS）測出土壤初始殘留量：四環素0.878 mg/kg，金霉素1.267 mg/kg，強力霉素0.381 mg/kg，磺胺二甲基嘧啶0.177 mg/kg。

實驗空白組與種植黑麥草后同期四環素類和磺胺類抗生素殘留量對比如圖1～圖4所示。

圖1 空白樣與實驗樣中四環素（TC）的降解效果對比

圖2 空白樣與實驗樣中金霉素（CTC）的降解效果對比

圖3 空白樣與實驗樣中強力霉素（DC）的降解效果對比

圖4 空白樣與實驗樣中磺胺二甲基嘧啶（SM2）的降解效果對比

2.2 黑麥草對土壤中喹諾酮類抗生素的降解

液相色譜-質譜（LC-MS/MS）測出土壤初始殘留量：恩諾沙星0.294 mg/kg，洛美沙星0.543 mg/kg，環丙沙星0.236 mg/kg，諾氟沙星1.439 mg/kg。

實驗空白組與種植黑麥草后喹諾酮類抗生素的殘留量如圖5～圖8所示。

圖5 空白樣與實驗樣中諾氟沙星（NOR）的降解效果對比

圖6 空白樣與實驗樣中洛美沙星（LOM）的降解效果對比

圖7 空白樣與實驗樣中恩諾沙星（ENR）的降解效果對比

圖8 空白樣與實驗樣中環丙沙星（CIP）的降解效果對比

2.3 分析與討論

（1）黑麥草對土壤中四環素類和磺胺類抗生素的降解效果

黑麥草對土壤中四環素類和磺胺類抗生素的降解效果不盡相同。其中對四環素的降解率為31.3%，金霉素的降解率為38%，強力霉素的降解率為29.4%，磺胺二甲基嘧啶的降解率為19.2%。經分析可知，黑麥草對磺胺二甲基嘧啶的降解率最低，對金霉素的降解率最高。在實驗空白組中，四環素類和磺胺類抗生素的土壤殘留含量趨于平穩，含量的大小差異比較微小，基本排除了除黑麥草之外其他因素的降解干擾。由此可見，黑麥草對土壤中四環素類和磺胺類抗生素有一定的降解效果。

（2）黑麥草對土壤中喹諾酮類抗生素的降解效果

黑麥草對土壤中喹諾酮類抗生素的降解效果也有一些差異。其中對恩諾沙星的降解率為24.8%，環丙沙星的降解率為34.3%，洛美沙星的降解率為22.3%，諾氟沙星的降解率為35%。其中黑麥草對諾氟沙星和環丙沙星的降解率比較高，洛美沙星的降解率相對較低。在實驗空白組中，土壤中殘留的喹諾酮類抗生素含量變化較少，趨于平穩，差異也比較微小，基本排除了除黑麥草之外其他因素的降解干擾。由此可見，黑麥草對土壤中喹諾酮類抗生素也有一定的降解效果。

（3）黑麥草對土壤中殘留典型抗生素的降解效果

實驗得出，黑麥草對于喹諾酮類抗生素的降解效果比四環素類和磺胺類抗生素要好，可能與抗生素自身的理化性質有關。四環素類的土壤-水平衡系數（k）為100～3 900 L/kg，磺胺類抗生素的土壤水平衡系數（k）為0.9～10 L/kg，喹諾酮類的土壤-水平衡系數（k）為496～61 000 L/kg，喹諾酮類抗生素的數值比磺胺類抗生素高出近千倍。這可能就是黑麥草植物降解喹諾酮類抗生素比磺胺類抗生素的效果要好出許多的原因。除此之外，土壤的pH、濕度、孔隙率等對土壤中遺留的抗生素的降解、吸附、吸收和遷移也有重要的影響。

3 土壤中微生物活性和氧化作用的測定

3.1 土壤中微生物活性的測定

3.1.1 土壤微生物呼吸作用的測定（圖9）

圖9 黑麥草對抗生素污染土壤中微生物呼吸作用的影響

采用堿吸收法測定土壤呼吸作用，實驗步驟如下：

（1）將土壤樣品先進行預處理，準備500 mL的敞口玻璃瓶3個，再準備盛放液體的敞口瓶3個，每瓶中放入20 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液。將瓶子放入敞口玻璃瓶中。

（2）將20 g試驗土壤放于敞口玻璃瓶內，并加入0.1 g葡萄糖作為營養液。

（3）將敞口玻璃瓶的瓶口嚴封，放在28℃的恒溫箱中培養24 h。

（4）將盛放氫氧化鈉的小瓶取出，加入幾滴酚酞試劑，用0.1 mol/L鹽酸滴定。

（5）準備同樣規格體積的敞口玻璃瓶，不加入實驗土壤，其他步驟同上。

（6）根據空白樣和實驗樣的差值計算二氧化碳的釋放量。

3.1.2 土壤微生物氨化作用的測定

根據氨氮標準曲線可以得出公式

y=6.403 6x-0.135 42，R=0.999 4

根據測定的數據對照曲線查出氨氮質量，根據空白樣的數據算出土壤微生物氨氮的抑制率和刺激率（如圖10）。

圖10 黑麥草對抗生素污染土壤中微生物氨化作用的影響

3.2 分析與討論

在黑麥草降解抗生素的過程中，測定不同時間段抗生素的活性變化，從呼吸作用和氨化作用兩個方面進行分析和評價。

黑麥草對抗生素污染土壤中微生物的呼吸抑制有緩解作用。由圖9可知，土壤中微生物的呼吸作用在前15天左右呈現抑制，原因可能是抗生素污染對土壤中微生物的酶活和其他生命活動產生了抑制作用；15天后，由于植物吸收、轉移和降解作用使微生物的呼吸抑制得到緩解，刺激了植物呼吸作用中CO的產生。在降解過程中，種植了黑麥草的實驗土壤中微生物的呼吸強度是空白土壤的1.4倍。在實驗前10天微生物氨化作用不明顯，抑制率10%～40%，實驗中后期微生物的氨化作用刺激率開始逐級升高，上升趨勢明顯。種植了黑麥草后的土壤微生物的氨化強度比未種植的氨化強度高出了3.2倍。

通過實驗數據分析，黑麥草對抗生素污染土壤中微生物的活性刺激效果良好，有明顯的刺激和恢復效果。土壤中抗生素的濃度越高，對微生物的抑制作用越強；反之抑制效果越弱。因此，土壤中殘留抗生素的濃度如果一直比較高并得不到有效降低將對土壤的供氮能力產生一定影響。

4 降解過程中黑麥草根系體表特征分析

4.1 降解過程中黑麥草根系的變化（圖11）

圖11 黑麥草生長過程中根系體表特征

通過對黑麥草生長過程中植物體表特征進行分析，研究黑麥草根系的變化和土壤中殘留抗生素降解效果之間的關系，為植物吸附、遷移和降解土壤中殘留抗生素類有機物提供依據。

利用根系分析儀對不同生長時間階段下的黑麥草植物根系的總長度、總切面面積、總表面積等特征進行研究分析。

4.2 分析與討論

試驗發現，黑麥草在生長過程中根系變化明顯，在實驗的第40天根系總長度為35.62 mm，平均長度為8.96 mm，平均直徑為0.233 5 mm，總切面面積為0.059 6 cm，總表面積為0.187 3 cm，平均切面積為0.008 8 cm，平均表面積為0.027 7 cm。根系的各方面指標和土壤中抗生素含量減少有關。同時，植物根系的生長發育對被抗生素抑制活性的微生物也有一定的刺激恢復作用。植物協同微生物的修復功能在一定程度上對土壤中殘留抗生素的降解起到了促進作用。

5 結論與展望

本實驗研究了黑麥草對土壤抗生素的降解及其機理，結論如下：

（1）黑麥草對土壤中殘留的典型抗生素的降解效果差異比較明顯。對CTC的降解率最高，為38%；SM2的降解率最低，為19.2%。對NOR和CIP的降解率分別為35%和34.3%，LOM的降解率相對最低，為22.3%。

（2）黑麥草可以明顯改善土壤中微生物的生物活性，提高其刺激率，對抗生素污染土壤中微生物的呼吸抑制有緩解作用。種植了黑麥草的實驗土壤中微生物的呼吸強度是空白土樣中的1.4倍。對于土壤微生物的氨化作用，在實驗前10天微生物氨化作用的抑制率范圍為10%～40%，實驗中后期微生物的氨化作用刺激率開始逐級增高，上升趨勢明顯。種植黑麥草后的土壤微生物的氨化強度比未種植的氨化強度高出了3.2倍。

（3）在黑麥草的整個生長周期中，其根系的體表特征發生了明顯變化，根系在前10～25天受抗生素殘留的影響，增長速度較慢，隨著抗生素的降解，25～30天根系各方面指標的增長速度較快，30～40天趨于平穩。