M-MDSC在非霍奇金淋巴瘤中表達及臨床意義

王 盼 王芝濤

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL) 發病率高, 是最常見的淋巴瘤亞型。近年來，隨著CD20單抗(利妥昔單抗)為基礎的免疫化療方案在臨床的逐漸應用，以及造血干細胞移植技術的逐漸成熟，極大地延長了NHL患者的生存期。然而，NHL在臨床上只能緩解，不能根治。尤其是，腫瘤復發后，治療效果極差。因此，有必要針對NHL的發病機制進行深入研究。髓系來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC) 是一群未成熟的具有負向調節作用的免疫細胞亞群。MDSC在炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病中呈現高表達狀態，并通過抑制宿主先天和獲得性免疫功能，造成宿主免疫功能穩態的失衡。然而，關于M-MDSC在NHL患者中的表達情況鮮有報道。本研究擬探討NHL患者外周血中M-MDSC的表達水平及其在臨床中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月至2020年1月解放軍第901醫院和安徽醫科大學第二附屬醫院醫院血液內科35例初診NHL患者作為試驗組，男性18例，女性17例；平均年齡(53.23±9.46)歲。同期選取健康體檢中心志愿者20例作為對照組，男性10例，女性10例；平均年齡(51.52±9.28)歲。兩組研究對象均無自身免疫性疾病、傳染病及其他腫瘤。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 CD14-FTTC、HLA-DR-PE和CD45-PC5流式免疫熒光抗體均購于美國Beckman Coulter公司。

1.3 外周血M-MDSC測定 采集研究對象靜脈血2 mL。取出100 μL，加入CD14-FTTC、HLA-DR-PE以及CD45-PC5單克隆抗體各5μL，室溫下孵育15 min，采用流式細胞儀(FC500 MPL, Beckman Coulter公司，USA)收集細胞。本研究中以CD14HLA-DR作為M-MDSC的免疫表型。

1.4 Arg-1水平檢測 Arg-1 ELISA試劑盒(R&D公司，USA)用于檢測研究對象外周血中Arg-1水平。

1.5 RNA抽提及RT-PCR檢測iNOS mRNA水平 使用Trizol法(Invitrogen公司)提取研究對象外周血中總RNA，逆轉錄合成cDNA，再進行RT-PCR擴增及檢測。內參基因β-actin序列：上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游：5’-CTAAGTCATAGTCCGCTAGAAGCA-3’。iNOS引物序列：上游5’-CTTTCCAAGACACACTTCACCA-3’，下游：5’-TATCTCCTTTGTTACCGCTT CC-3’。

2 結果

2.1 兩組研究對象外周血中M-MDSC表達水平比較 試驗組患者外周血中M-MDSC表達水平為(32.64±11.23)%，高于對照組的(12.13±4.72)%，差異有統計學意義(

t

=7.372,

P

=0.002)。見圖1。

圖1 兩組研究對象M-MDSC流式圖(D4象限內為M-MDSC)

2.2 不同臨床病理特征NHL患者M-MDSC水平比較 Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期患者M-MDSC水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，LDH升高患者的M-MDSC水平高于LDH正常患者，IPI評分3～5分患者M-MDSC水平高于0～2分患者，差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征NHL患者M-MDSC水平比較

2.3 兩組研究對象Arg-1、iNOS mRNA水平比較 試驗組患者Arg-1和iNOS mRNA水平均高于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象Arg-1、iNOS mRNA水平比較

3 討論

MDSC具有抑制宿主抗腫瘤免疫反應,促進腫瘤細胞免疫逃逸的作用，一直是腫瘤免疫研究的熱點。MDSC可分為粒細胞型MDSC和單核細胞型MDSC。研究表明，單核細胞型MDSC相較于粒細胞型MDSC具有更強的免疫抑制作用。因此，前期多數研究集中于單核細胞型MDSC。本研究中，單核細胞型MDSC表達水平在初診NHL患者中顯著升高，提示NHL患者存在明顯的免疫穩態失衡。NHL腫瘤細胞通過分泌G-CSF、GM-CSF及IL-6等多種細胞因子，誘導髓系前體細胞進入外周血并大量增殖、分化，形成單核細胞型MDSC。高表達狀態的單核細胞型MDSC通過抑制T、B和NK等細胞的免疫功能，進而減弱了NHL患者的抗腫瘤免疫反應能力，促進了腫瘤的發生和進展，與Lin等研究結果一致。Khalifa等發現，MDSC表達水平在B細胞非霍奇金淋巴瘤患者中顯著升高，將MDSC移除后，IL-10等細胞因子水平顯著下降，T細胞增殖顯著恢復。表明MDSC對于促進非霍奇金淋巴瘤的發病具有重要作用。

研究表明，M-MDSC在多種腫瘤患者中表達水平升高，并且與腫瘤進展密切相關。Tadmor等報道，MDSC在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中表達水平顯著升高，并與腫瘤分期密切相關。Romano等研究發現，對單核細胞型MDSC、粒細胞型MDSC和未分化CD34MDSC在60例初診霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)患者外周血中的表達水平進行了分析。在初診時，所有MDSC亞群在HL患者中表達均高于對照組。尤其是在進展期HL患者中，MDSC的表達水平進一步升高。本研究中，單核細胞型MDSC表達水平與NHL患者的腫瘤分期、LDH水平及IPI評分密切相關。然而，單核細胞型MDSC與NHL患者性別、年齡及病理分型未見明顯相關性。腫瘤分期可以反映NHL的腫瘤負荷，LDH水平和IPI評分被認為是NHL不良預后的標志。表明單核細胞型MDSC不僅參與了NHL患者腫瘤的發生，且與腫瘤的進展及預后具有一定相關性。

單核細胞型MDSC通過分泌多種細胞因子發揮負向調節作用。在多種腫瘤及炎癥性疾病中，均發現存在高表達狀態的Arg-1和iNOS，并且與MDSC的水平密切相關。Lauretd等認為，Arg-1和iNOS是單核細胞型MDSC發揮負向免疫調控最重要的2個因子。其通過消耗效應T細胞增殖所必需的精氨酸和半胱氨酸，從而抑制效應T細胞增殖和發揮抗腫瘤免疫作用。Zhang等研究發現，經過Arg-1和iNOS中和試驗后，效應T細胞的增殖能力顯著恢復。本研究中，試驗組患者外周血中Arg-1和iNOS mRNA水平相比對照組顯著升高。表明單核細胞型MDSC也是通過分泌Arg-1和iNOS抑制NHL患者抗腫瘤免疫反應，進而促進了腫瘤細胞的免疫逃逸。通過靶向去除或者抑制Arg-1和iNOS的活性，可能有助于恢復NHL患者的抗腫瘤免疫作用。

綜上， NHL患者外周血中單核細胞型MDSC表達水平顯著升高，且與疾病進展密切相關。通過調控單核細胞型MDSC數量或功能可能有助于提高宿主抗腫瘤免疫反應，為NHL的免疫治療提供新思路。