枸杞多糖對獲能新鮮和凍后豬精子抗氧化能力的影響

馮妮，陳志英，謝運法，李美珍，馮顯鈐，唐榮福，胡傳活*，唐胤晟*，李銘*

(1. 廣西大學動物科技學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西畜禽品種改良站，廣西 南寧 530001；3. 廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001)

隨著養豬生產技術的發展，人工授精技術被廣泛應用，提高人工授精效率顯得尤為重要。人工授精過程中，精子發生頂體反應之前，獲能是一個重要的生理先決條件[1]。而哺乳動物精子獲能期間的一個早期事件是產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[2]，ROS的產生和氧化應激與氧化還原損傷直接相關[3]。研究表明，氧化應激是損傷精子質量的主要因素之一[4]。精子獲能過程中產生的過多氧化物質會導致精子受精所需的結構和功能發生改變甚至丟失[5]，極大地限制了人工授精技術的廣泛推廣。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是一種常見天然中藥提取物。近年來研究表明，LBP具有多種生物活性和藥理作用，可通過調節垂體性腺軸，維持生殖激素之間的平衡，進而維持正常的生精環境[6]。此外，LBP已被證明在豬精液冷凍保存中是一種天然抗凍劑[7]。一系列研究還探討了LBP對睪丸組織的保護作用，表明其可以通過減少睪丸組織的氧化應激進而表現出對精子的保護作用[8]。LBP不僅能夠逆轉鎘引起的血清睪酮水平下降趨勢[9]，還能阻斷生精細胞凋亡的相關途徑[10]。盡管研究表明LBP能用于治療多種疾病，并作為抗氧化劑促進機體健康和長壽，但其對精子獲能過程中抗氧化功能的影響研究未見報道。本試驗旨在評價LBP對獲能新鮮和凍后豬精子抗氧化能力的影響，為進一步提高豬的人工授精效率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮精液，手握法采自廣西科達畜禽改良有限責任公司體況相近的杜洛克公豬，按廣西大學動物解剖實驗室沿用方法[11]冷凍。精子培養液(Biggers-Whitten-Whittingham，BWW)購自上海美吉生物醫藥科技有限公司。LBP(純度50%)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、細胞熒光凋亡Hoechst 33342/PI雙染試劑盒和伊紅染液，均購自北京Solarbio Science有限公司。超微量紫外分光光度計，購自天根生化科技有限公司。

1.2 精子獲能處理

離心富集后的新鮮與凍后精子以PBS液1 000 r/min離心5 min洗滌。同樣的離心重復2次后，加入BWW培養液，將不同濃度LBP(2、4、8和16 mg/mL)與處理后的精子混勻，按文獻[12]操作孵育精子。

1.3 精子表觀指標檢測

按田恒玖[13]方法依次檢測獲能處理后豬精子活率、質膜完整性、頂體完整率。精子線粒體活性和精子細胞凋亡Hoechst 33342/PI雙染按Solarbio Science公司說明操作。

1.4 精子抗氧化能力的檢測

使用最佳濃度LBP處理獲能精子后，分別按試劑盒操作說明測定精子T-AOC、SOD活性及MDA含量。

1.5 精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達量分析

精子在上述處理的基礎上加入1 μmol/L氯化鎘處理[14]，誘導氧化應激后采用TRIzol法提取各組精子的總RNA，使用超微量紫外分光光度計測定各組別RNA的A260/A280在1.8～2.0。隨后用Gene Star 反轉錄合成cDNA，采用華大基因有限公司合成的引物，按照SYBR Green方法檢測SOD-1(上游引物:ATGGTGTGGCCACTGTGTACA；下游引物：CCACCTCTGCCCAAGTCATC)和Caspase-8(上游引物：TCAAGTTCCTGAGCCTGGAC；下游引物：GCATGACCCTGTAGGCAGA) 基因mRNA表達水平。以β-actin(上游引物：CTAGTTACACACACGCGGCTCT；下游引物：CATGAATACCCTGCACAGATCG)作為內參基因，每個樣本重復3次。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。

1.6 數據統計與分析

用SPSS 23.0統計學軟件對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數據用 “平均值±標準差”表示，以P<0.05 為差異顯著的判斷標準。用GraphPad 7.0軟件對數據進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度LBP對獲能新鮮和冷凍精子表觀指標的影響

由表1可見，新鮮精子中，2 mg/mL LBP獲能精子活率和頂體完整率顯著高于空白組和16 mg/mL組(P<0.05)。2 mg/mL LBP獲能精子質膜完整性達到最高(P<0.05)。由表2可見，冷凍精子中，8 mg/mL LBP的獲能精子活率、線粒體活性和頂體完整率顯著高于空白組、2 mg/mL組、4 mg/mL組(P<0.05)，而質膜完整性則顯著低于空白組和其他試驗組(P<0.05)。綜合分析，選取2和8 mg/mL LBP為鮮精和凍精最適濃度。

表1 不同濃度LBP對獲能新鮮精子表觀指標的影響 %

表2 不同濃度LBP對獲能凍后精子表觀指標的影響 %

2.2 Hoechst 33342/PI雙染精子凋亡情況

精子在最適濃度LBP處理后，Hoechst 33342/PI雙染結果顯示正常精子：弱紅色熒光+弱藍色；凋亡精子：弱紅色熒光+強藍色；壞死精子：強紅色+強藍色。圖1結果顯示：新鮮精子獲能試驗組較獲能空白組中視野內正常精子數目較多；凍后精子獲能試驗組較獲能空白組中強紅色熒光信號較強，獲能試驗組精子壞死減少。

圖1 精子Hoechst 33342/PI雙染結果(標尺=50 μm)

2.3 最適濃度LBP對獲能豬精子抗氧化指標的影響

T- AOC如圖2所示，新鮮精子和凍后精子中，相比較獲能空白組，獲能試驗組T-AOC均顯著增加(P<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同

SOD活性如圖3所示，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗組較獲能空白組SOD活性均顯著增加(P<0.05)；MDA含量如圖4所示，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗組與獲能空白組MDA含量均差異不顯著(P>0.05)。

圖3 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD活性的影響

圖4 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子MDA含量的影響

2.4 最適濃度LBP對獲能豬精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達量的影響

由圖5可知，加氯化鎘誘導氧化應激后，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗組較獲能空白組SOD-1 mRNA表達量均顯著增加(P<0.05)。

圖5 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD-1 mRNA表達量的影響

由圖6可知，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗組較獲能空白組Caspase-8 mRNA表達量均顯著下調(P<0.05)。

圖6 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子

3 討論

現代藥理學研究顯示，LBP作為一種常見的抗氧化劑，不僅能夠提高輻射誘導的少弱精子癥模型小鼠精子懸液SOD 活力、降低MDA含量，減輕睪丸組織氧化損傷，還能夠促進生殖腺的發育和恢復[15]，提高精子數量和活力[16]，進而保護精子的抗氧化系統。人工授精過程中，在精子發生頂體反應之前，精子獲能是必要的。ROS是精子獲能過程中產生的物質之一，ROS調節精子獲能，涉及精子與卵母細胞周圍的透明帶結合，誘導頂體反應，使卵母細胞受精[17]。過量的ROS，在生殖方面表現為影響精子細胞膜完整性、活率和活力等相關指標[18]。雄性生殖系統本身就是一個產生高濃度ROS的部位，易導致精子DNA損傷、中斷或阻礙精卵融合，最終影響動物繁殖能力[19]。因此當抗氧化劑的含量越高時，ROS的含量就會因此下降，可促進精子保持完整的形態，提高精卵結合率。

Qiu等[20]證實了LBP可以顯著提高雞體內GSH-Px和SOD活性。LBP還可以提高大鼠血清中GSH-Px和SOD 的活性[21]。本研究發現試驗組較空白組相比SOD活性升高，這一結果與上述文獻報道的LBP增加SOD活性結果一致。此外，LBP可以保護雄性大鼠的生殖功能，增加線粒體膜電位進而緩解精子發生凋亡[22]。在本研究中，Hoechst 33342/PI雙染細胞凋亡結果顯示，較未加LBP組，加LBP組獲能豬精子出現精子線粒體膜電位較高，同時，凋亡現象相對較少。LBP所含的多種糖類物質能影響膜對羥自由基的清除，從而影響精子抗氧化功能和MDA的產生[23]。然而，在本研究中，LBP對精子的MDA含量及質膜完整性沒有明顯的改善作用，其原因有待于進一步探索。

加氯化鎘處理時，獲能試驗組較獲能空白組，SOD-1 mRNA表達量受LBP劑量的顯著影響。相比于凍后精子，新鮮精子在最適濃度LBP影響下，SOD-1 mRNA表達量上調顯著，這表明在氯化鎘體外誘導氧化應激過程中，LBP能顯著增加獲能精子抗氧化能力，進一步驗證LBP在豬精子獲能過程中的抗氧化作用。在人體睪丸組織中，凋亡對于睪丸發育以及精子分化具有重要作用[24]。其中Caspase在凋亡機制中起著重要的作用，主要通過線粒體途徑和膜死亡受體途徑介導細胞凋亡，Caspase-8 是其中最重要的啟動因子之一[25]。從精子中分離出來的Caspase可以對射精后精子凋亡情況進行反映[26]。新鮮精子和凍后精子試驗組Caspase-8 mRNA表達量顯著下調也更好地佐證LBP能夠減少獲能豬精子的自我損傷。

綜上所述，在新鮮或凍融豬精子獲能過程中分別添加2 mg/mL和8 mg/mL LBP可以提高獲能精子SOD和T-AOC活性，影響精子獲能過程中SOD-1和Caspase-8 mRNA表達量，表明LBP能通過提高精子的抗氧化能力，減少精子的損傷，協助獲能反應進行。