固相萃取-反相高效液相色譜法測定蛋黃中的斑蝥黃

王鳳芹 劉 鑫 程遠之 郭冠群 路則慶 汪以真

(浙江大學飼料科學研究所，農業農村部(華東)動物營養與飼料重點實驗室，浙江省飼料與動物營養重點實驗室，杭州 310058)

雞蛋是許多國家重要的食物之一，雞蛋除了含有蛋白質、脂肪等常規營養物質外，還含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素在蛋黃中沉積賦予其金黃色或橙色[1]。斑蝥黃化學名稱為β,β-胡蘿卜-4,4-二酮，主要有全反式(圖1)和順式(圖2)2種異構體[2]，它作為一種重要的類胡蘿卜素類紅色色素，被用作禽類的著色劑，以增強禽類皮膚、肌肉以及蛋黃的顏色[3]。除此之外，就像其他類胡蘿卜色素一樣，它還是一種有效的抗氧化劑[4]，但是攝取過量的斑蝥黃可能在人和動物的視網膜上沉積，導致視覺問題[5]。為此，歐洲食品安全局和日本厚生勞動省規定了蛋黃中斑蝥黃的最高殘留限量分別為30和25 μg/g[6]。因此，有必要建立針對蛋黃中斑蝥黃的定量檢測方法，為禽蛋質量安全風險監測提供依據，繼而可以為社會關切的“化妝的土雞蛋”進行準確地質量評價，為養殖場科學、合理使用色素添加劑提供指導。

圖1 全反式斑蝥黃的化學結構

圖2 9-順式斑蝥黃的化學結構

目前，對于禽蛋蛋黃中斑蝥黃殘留的檢測尚無相應的標準方法。文獻報道的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[7-9]、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)法[2,10-11]?；诟咝б合嗌V法和高效液相色譜-質譜聯用法分析蛋黃中斑蝥黃的儀器方法已經很成熟，但是往往忽略了對斑蝥黃順反異構體的定量[1,12-13]，而據文獻報道，斑蝥黃順式異構體較全反式異構體具有更強的抗氧化性能[14]。另外，減少蛋黃中脂類物質的干擾以獲得較高的回收率、簡便的提取和凈化方法，從而建立準確、快速的蛋黃中斑蝥黃順反異構體定量分析方法則是一項挑戰。

蛋黃中脂類物質的去除主要有以下3種途徑。皂化法：Larsen等[15]使用氫氧化鉀的甲醇溶液提取葉黃素類物質，但是皂化過程會導致色素降解[2]，因此該方法在后續文獻中較少報道。固相萃取(SPE)法：先使用有機溶劑從樣品基質中提取斑蝥黃，比較常見的溶劑有乙腈[16-17]、甲醇[12]、丙酮[12]、石油醚-甲醇-乙酸乙酯混合溶液[9]、乙腈-乙酸乙酯混合溶液[13]以及無水乙醇-二氯甲烷混合溶液[18]等，隨后經C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE、中性氧化鋁-SPE凈化[1,6]。上述乙酸乙酯和二氯甲烷等提取體系對蛋黃中斑蝥黃提取完全，但萃取液中含有大量的脂類物質，造成了固相萃取柱堵塞，明顯導致斑蝥黃的回收率過低；此外，凈化過程將斑蝥黃提取液經過C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化鋁-SPE等固相萃取柱凈化，大都采用復雜的活化、平衡步驟，在真空泵下操作，費時費力。液液萃取法：采用正己烷等非極性溶劑分次對蛋黃的乙腈提取液進行萃取除脂[17]。乙腈對蛋黃中的斑蝥黃具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，雖然成本低，但是有機溶劑消耗量大，正己烷在萃取除脂的過程中造成了部分斑蝥黃損失，也導致斑蝥黃回收率偏低。

針對現有蛋黃中斑蝥黃檢測方法前處理方法復雜、因脂類物質干擾而導致回收率較低、不能對斑蝥黃順反異構體同時定量的問題，本試驗選用乙腈超聲提取蛋黃中斑蝥黃，取部分提取液與水混合后直接通過PRiME HLB固相萃取柱凈化，濃縮后由反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測，該方法較上述方法易于操作且回收率高，可實現對蛋黃中斑蝥黃的快速、準確定量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 雞蛋

從綜合性大型超市采購新鮮白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和土雞蛋各10枚。

1.1.2 試劑

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀(e2695，美國Waters公司)、超聲波清洗器(KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)、純水儀(Millipore，德國EMD Millipore公司)、電子分析天平(ME204E，瑞士Mettler Toledo公司)、離心機(ST 40R，美國Thermo Scientific公司)、氮吹儀(N-EVAP 112，美國Organomation公司)。

1.2 色譜分析條件

Welch C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭公司)；進樣量20 μL；流動相為乙腈-水(95∶5，體積比)；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測器：波長474 nm。

1.3 標準曲線的制備

稱取斑蝥黃62.5 mg(精確到0.000 1 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻，配制成濃度為1 250 μg/mL的斑蝥黃標準儲備溶液。分裝后于-18 ℃保存。

準確移取1 250 μg/mL的斑蝥黃標準儲備溶液，用乙腈配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg/mL的標準工作溶液。現配現用。

1.4 樣品的提取與凈化

1.4.1 乙腈提取HLB固相萃取柱凈化(ACN-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，用玻璃棒充分攪拌，混合均勻，超聲提取10 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重復提取、離心，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。準確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，再加入5 mL水，超聲混勻后過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮氣吹干，準確加入0.5 mL乙腈溶解殘渣，以5 000×g離心5 min，取上清液上機測定。做3次平行測定。

1.4.2 乙腈提取正己烷分次萃取(ACN+n-Hexane)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g)于50 mL離心管中，加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，用玻璃棒充分攪拌，混合均勻，超聲提取10 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液用20 mL乙腈飽和的正己烷萃取，收集乙腈相至50 mL容量瓶中，沉淀重復提取1次，合并乙腈相于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。準確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，準確加入0.5 mL乙腈溶解殘渣，以5 000×g離心5 min，取上清液上機測定。做3次平行測定。

1.4.3 乙腈-乙酸乙酯提取HLB固相萃取柱凈化(ACN+EA-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.001 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1，體積比)，用玻璃棒充分攪拌，混合均勻，超聲提取10 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重復提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用提取溶劑定容至刻度，搖勻，備用。準確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，加入5 mL乙腈，超聲15 s，再加入5 mL水，超聲混勻過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮氣吹干，準確加入0.5 mL乙腈溶解殘渣，以5 000×g離心5 min，取上清液上機測定。做3次平行測定。

1.4.4 無水乙醇-二氯甲烷提取HLB固相萃取柱凈化(Ethanol+DCM-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.001 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL無水乙醇-二氯甲烷(體積比，1∶1)，用玻璃棒充分攪拌，混合均勻，超聲提取10 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重復提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用相應的提取溶劑定容至刻度，搖勻，備用。準確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，加入5 mL 乙腈，超聲15 s，再加入5 mL水，超聲混勻過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮氣吹干，準確加入0.5 mL乙腈溶解殘渣，以5 000×g離心5 min，取上清液上機測定。做3次平行測定。

1.5 加標回收率試驗

篩選不含斑蝥黃的雞蛋——空白雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g)，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉，再向其中分別加入0.2 mL濃度分別為1.25、25.00和100.00 μg/mL的斑蝥黃標準溶液，使蛋黃中斑蝥黃加標濃度分別為0.1、1.0和4.0 μg/g，按1.4步驟提取與凈化，計算回收率及相對標準偏差。

1.6 其他色素干擾性試驗

制備蝦青素、玉米黃質、葉黃素、斑蝥黃、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯混合標準溶液(0.1～0.5 μg/mL)，上機測定，以考察上述色素的色譜分離情況。

1.7 斑蝥黃檢測方法的應用

對所采購的白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和本雞蛋，采用1.4.1試驗步驟進行前處理并采用高效液相色譜儀分析其斑蝥黃含量。

1.8 定性與定量

以斑蝥黃異構體的紫外-可見吸收光譜圖做比對，進行進一步的組分定性；統計色譜圖中斑蝥黃順反異構體峰面積總和，根據斑蝥黃標準曲線方程，采用外標法對樣品中斑蝥黃進行定量[2]。

試樣中斑蝥黃的含量(順反式斑蝥黃總量)以質量分數(w)表示，數值以微克每克(μg/g)表示，按下式計算：

w=(ρ×V×V2×n)/(m×V1)。

式中：ρ表示由標準工作曲線得到的試樣溶液中斑蝥黃的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；V表示提取液的定容體積，單位為毫升(mL)；V1表示用于凈化的提取液體積，單位為毫升(mL)；V2表示凈化后最終定容體積，單位為毫升(mL)；n表示稀釋倍數；m表示試樣的質量，單位為克(g)。

1.9 數據處理與分析

數據處理采用Excel 2020統計分析軟件進行處理和計算，結果以平均值來表示。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍

按1.3步驟進行處理，以斑蝥黃的標準溶液濃度為橫坐標(x)，斑蝥黃順反異構體色譜峰面積(響應值)總和為縱坐標(y)，繪制標準曲線。測定結果顯示，斑蝥黃在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內，其標準曲線方程為y=173 321x-9 521，相關系數(R2)為0.999 9，色譜圖見圖3。

圖3 斑蝥黃標準溶液(1.0 μg/mL)色譜圖

2.2 方法的檢出限與定量限

向空白雞蛋中添加斑蝥黃使之濃度為0.1 μg/g，其信噪比(S/N)大于10，并且經前處理后其濃度在線性范圍內，該方法的檢出限則根據S/N=3，確定的檢出限可達到0.05 μg/g。所以最終確定方法的定量限為0.1 μg/g(圖4)，檢出限為0.05 μg/g，滿足分析方法性能的要求。

圖4 空白蛋黃添加斑蝥黃(0.1 μg/g)色譜圖

2.3 樣品的前處理方法優化

考慮到蛋黃中含有大量脂類物質，本試驗開展了針對乙腈提取液的正己烷分次萃取除脂研究，同時考察了乙腈-乙酸乙酯、無水乙醇-二氯甲烷2個不同混合溶劑提取體系對蛋黃中斑蝥黃的提取效率(與乙腈提取體系對比)。乙腈由正己烷脫脂和乙腈-乙酸乙酯、乙腈和無水乙醇-二氯甲烷3種提取溶劑提取再經固相萃取柱凈化后的回收率結果見圖5。

圖5 不同前處理對斑蝥黃回收率的影響

2.4 方法的準確度與精密度

在確定最佳提取體系后，計算斑蝥黃在不同加標濃度下的回收率及相對標準偏差，結果見表1。在加標濃度為0.1～4.0 μg/g的濃度范圍內，斑蝥黃回收率為85.9%～98.6%，相對標準偏差(RSD)為1.7%～8.0%。

表1 斑蝥黃回收率試驗結果

2.5 其他色素干擾性試驗

常用的著色劑如葉黃素、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯，常被飼料生產商和養殖場添加至飼糧中，為了驗證該方法能夠很好地測定出蛋黃中斑蝥黃的含量，而不被其他色素所干擾，本試驗考察了蝦青素、玉米黃質、葉黃素、斑蝥黃、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯混合標準溶液的色譜分離情況，圖6顯示，在保留時間在11.7 min左右，沒有除斑蝥黃以外的干擾峰。

2.6 檢測方法的應用

對所采購的白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和土雞蛋采用1.4.1試驗步驟進行前處理并經過高效液相色譜儀分析其斑蝥黃含量，結果見表2。

表2 市售不同類型雞蛋斑蝥黃含量測定結果

2.7 定性與定量

斑蝥黃的順反異構體紫外-可見吸收光譜圖如圖7所示：全反式斑蝥黃的最大吸收波長為474 nm左右，而順式斑蝥黃的最大吸收波長為464 nm左右，除此之外，其在364 nm處還有1個明顯的肩峰。

圖7 全反式斑蝥黃(A)和順式斑蝥黃(B)紫外-可見吸收光譜圖

3 討 論

3.1 前處理條件的選擇

通過比較針對乙腈提取液的2種脫脂方法——正己烷分次萃取除脂和固相萃取柱凈化，以及乙腈、乙腈-乙酸乙酯、無水乙醇-二氯甲烷3個不同溶劑提取體系對蛋黃中斑蝥黃的提取試驗發現：乙腈對蛋黃中的斑蝥黃具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，雖然成本低，但是有機溶劑消耗量大，正己烷在萃取除脂的過程中造成了部分斑蝥黃損失，導致斑蝥黃回收率偏低，平均回收率不到80%(如圖5所示)；乙腈-乙酸乙酯和無水乙醇-二氯甲烷提取液中基質在固相萃取柱上形成較強吸附，明顯降低了斑蝥黃的回收率，二者的平均回收率分別為37.1%和45.5%(如圖5所示)。此外，斑蝥黃提取過程中未凈化完全的基質在色譜柱不能被完全洗脫，造成了色譜柱柱效降低，也使得儀器系統壓力升高。

斑蝥黃具有脂溶性，并具有很強的疏水性，而PRiME HLB作為反相固相萃取吸附劑，對斑蝥黃具有很好的保留。整個凈化過程無需要活化和平衡，在常壓下實現了樣品的凈化。文獻報道的將斑蝥黃提取液經過C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化鋁-SPE等固相萃取柱凈化，大都采用復雜的活化、平衡步驟，在真空泵下操作；乙腈作為斑蝥黃的提取溶劑，與水混勻后，直接過固相萃取柱，無需濃縮至干，避免了加熱可能造成的斑蝥黃分解。

因此，本試驗選用乙腈超聲提取蛋黃中斑蝥黃，取部分提取液與水混合后直接通過PRiME HLB固相萃取柱凈化。

3.2 方法學考察

斑蝥黃在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內呈現良好線性關系良好，相關系數大于0.999；蛋黃中斑蝥黃的檢出限為0.05 μg/g，定量限為0.1 μg/g，說明該方法具有較好的靈敏度；在低、中、高3個加標濃度下，斑蝥黃的平均回收率大于85%，相對標準偏差小于10%，說明該方法具有較高的準確性和精密度；常見色素色譜峰對斑蝥黃的順反異構體色譜峰沒有產生干擾，表明該方法專一性好；通過應用發現，該方法適用于對市場上新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃的快速、準確檢測。

3.3 斑蝥黃的定性與定量

在對斑蝥黃定量時統計的是2種異構體的總量[2]。斑蝥黃標準品主要成分為全反式異構體，含量達95%以上，其次還有部分順式異構體。而對雞蛋黃中斑蝥黃分析過程中發現，斑蝥黃順式異構體約占15%。

4 結 論

① 本試驗采用乙腈在超聲波輔助下成功提取了蛋黃中的斑蝥黃，斑蝥黃乙腈提取液用水稀釋后直接過PRiME HLB固相萃取柱，以乙腈和水的混合溶液洗脫，乙腈淋洗，即可完成樣品的前處理。

② 蛋黃中斑蝥黃的檢出限為0.05 μg/g，定量限為0.1 μg/g。斑蝥黃在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好，相關系數大于0.999。在3個加標濃度(0.1、1.0和4.0 μg/g)下，斑蝥黃的回收率為85.9%～98.6%，相對標準偏差為1.2%～8.0%。

③ 應用上述乙腈提取+固相萃取-反相高效液相色譜法對市場上新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃進行檢測，結果顯示所選購市售雞蛋蛋黃中斑蝥黃含量差異較大，從低于0.1 μg/g到高達8.3 μg/g不等。

④ 綜上可知，本試驗建立的固相萃取-反相高效液相色譜法測定蛋黃中斑蝥黃的方法可應用于對新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃的快速、準確定量。