珍珠龍膽石斑魚閉鎖小帶蛋白-1、閉鎖蛋白和跨膜蛋白-15a基因的克隆及其在精氨酸干預下的腸道組織表達

陳東鴻 崔 曉 李 廣 何 凱 韓煜軒 陳冠霖 楊奇慧,2 遲淑艷,2*

(1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，湛江 524025)

目前已知上皮細胞黏附結構存在4種連接方式，其中細胞間緊密連接(tight junction，TJ)是廣泛存在于上皮及內皮細胞中的不通透連接，由閉鎖蛋白(Occludin)、跨膜蛋白(Claudin)、緊密連接黏附分子(JAMs)和閉鎖小帶蛋白(ZO)及與其相連接的細胞骨架蛋白組成，負責調節離子和其他溶質的細胞旁運動，對上皮和內皮屏障的形成和功能起到至關重要的作用[1-2]。構成緊密連接的主要骨架蛋白Claudin是一個龐大的膜蛋白家族，目前哺乳動物中已發現27個家族成員[3]，Claudin的異常表達會導致組織的滲透屏障功能受損，細胞的極性完全消失，細胞間的黏附能力下降，進而導致內分泌紊亂[4]。哺乳動物的Occludin在進化上具有一定的保守性，N末端在緊密連接超微結構和屏障功能起重要作用，上調Occludin的表達可以增強腸道黏膜屏障的穩定性，敲除Occludin則會增加腸道緊密連接的通透性[5]。ZO是緊密連接支持結構的基礎，閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)與肌動蛋白微絲相連，一同參與細胞骨架的構成，并且ZO-1作為膜相關鳥苷酸激酶家族中的一員，可以游離于細胞膜和細胞核之間，在信號傳導中發揮重要作用[6]。緊密連接結構一旦損傷，細胞膜通透性就會增加，外界的有毒物質或者微生物代謝產物等便會滲透進入機體，造成損害。

魚類攝取營養物質，獲得健康生長和發育，與腸道黏膜屏障完整性密切相關。飼料中添加適量的氨基酸和維生素可以顯著上調草魚(Ctenopharyngodonidella)腸道Occludin、Claudin-3、Claudin-15amRNA的表達，增強黏膜細胞間緊密連接的保護，保護細胞的通透性，維持腸道和鰓絲黏膜屏障[7-11]；氨基酸缺乏或過量會通過雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號通路下調草魚腸道緊密連接蛋白Occludin、Claudin、ZO-1 mRNA的表達[12]，或者下調草魚腸道中Claudin-b和Claudin-3 mRNA的表達，破壞腸道黏膜屏障，削弱免疫狀態，誘發腸炎[13]。氨基酸是腸道生長發育的重要營養支持，飼料中大約40%的精氨酸(Arg)在小腸內直接被消化吸收，參與氧化供能，促進細胞增殖和黏膜上皮生長分化，維護腸黏膜屏障。本研究團隊前期試驗表明，適宜的飼料精氨酸水平有助于改善斜帶石斑魚腸道皺襞高度和肌層厚度，促進腸道發育和機體生長[14]。那么，精氨酸是否可通過調控緊密連接蛋白家族成員的表達維護石斑魚腸道機械屏障完整性呢？

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗使用同一遺傳背景的健康珍珠龍膽石斑魚，體重(11.0±0.5)g，采自東南碼頭石斑魚苗廠。用丁香酚(1∶10 000)麻醉后，冰盤上解剖獲得腦、鰓、皮膚、肌肉、肝臟、胃、腸(前、中、后)、頭腎、體腎、脾臟和心臟11種器官組織，每個樣品取3個重復，迅速放入裝有RNA later的EP管中，4 ℃存放過夜后置于-80 ℃冰箱保存，用于基因克隆及組織表達分布試驗。

1.2 動物設計和飼料配方

通過cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)-PCR技術克隆珍珠龍膽石斑魚ZO-1、Occludin和Claudin-15a的cDNA全長，運用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其在健康珍珠龍膽石斑魚腦、鰓、皮膚、肌肉、肝臟、胃、前腸、中腸、后腸、頭腎、體腎、脾臟和心臟13種組織中的mRNA相對表達量。

配制3組精氨酸水平分別為1.96%、3.06%和3.74%的等氮等脂試驗飼料，試驗飼料組成及營養水平見表1。選擇375尾珍珠龍膽石斑魚，初重為(20.79±0.09)g，隨機分為3組，每組5個重復，每個重復25尾魚。養殖8周后，每個重復隨機取3尾魚，剝離腸道放入無酶凍存管中，立即投入液氮中速凍，隨后轉移到-80 ℃冰箱中保存，用于分析飼料精氨酸水平對緊密連接蛋白基因mRNA表達的影響。飼料精氨酸水平參考本研究團隊前期試驗結果[14]。

表1 試驗飼料組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 總RNA提取及反轉錄

使用Trizol(Invitrogen公司，美國)試劑提取石斑魚組織的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法分別檢測確定總RNA的完整性及純度。以各組織總RNA(1 μg)為模板，Oligo(dT)20為反轉錄引物，使用Invitrogen公司M-MLV First-Strand Synthesis System操作方案，用不含RNA的DNase處理除去DNA污染物，總反應體系為10 μL：5×Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、總RNA 1 μL、RNA Free dH2O 6 μL。以各組織總RNA為模板并使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒進行反轉錄，反應體系為20 μL：去除基因組DNA產物10 μL、Primer Script RT Enzyme MixⅠ 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×Prime Script Buffer 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL。反應條件參考試劑盒說明書，合成cDNA第1鏈。

1.4 ZO-1、Claudin-15a、Occludin基因克隆

采用SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒(Clontech公司，美國)制備RACE-PCR的模板，根據NCBI數據庫已知基因的保守區設計擴增引物(表2)，得到ZO-1核心片段為5 106 bp片段，Claudin-15a核心片段為669 bp片段，Occludin核心片段為1 515 bp片段。通過BLAST搜索GenBank的數據庫鑒定所得序列為上述基因的部分cDNA序列，根據這些片段設計對應的RACE引物。PCR的步驟如下：94 ℃變性3 min，94 ℃變性20 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 s，擴增35個循環，72 ℃下延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠對RACE擴增產物進行電泳，以獲得目的片段。將目的片段連接至pMD18-T載體，轉化到DH-5A活性細胞后，獲得陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進行細菌液體PCR檢測。

表2 基因克隆引物序列

1.5 序列比對和系統發育分析

ZO-1、Claudin-15a、Occludin的序列由ORF Finder翻譯(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gotf.html)，利用Signal P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽序列。用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜結構域；使用ExPASy蛋白質組學工具(http://www.expasy.org/tools/)預測蛋白質結構。使用DNAMAN Package 6.0進行氨基酸多序列比對。用MEGA 7.0采用鄰接(neighbor joining，NJ)法構建ZO-1、Claudin-15a、Occludin氨基酸序列的分子系統發育樹。

1.6 RT-qPCR分析

采用RT-qPCR檢測ZO-1、Claudin-15a和Occludin在石斑魚腦、鰓、皮膚、肌肉、肝臟、胃、腸(前、中、后)、頭腎、體腎、脾臟、心臟中以及評價精氨酸對養殖試驗獲取的腸道中的mRNA表達水平。β-肌動蛋白(β-actin)(GenBank：AY510710.2)作為RT-qPCR的內參基因(表3)。反應條件如下：1個周期，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，58 ℃ 34 s，72 ℃ 20 s，40個循環。通過熔解曲線分析確定只有1種PCR產物。采用2-△△Ct法計算ZO-1、Claudin-15a、Occludin在各組織中的相對表達量。

表3 實時熒光定量PCR引物

1.7 生長指標計算

養殖試驗8周結束后，計算各重復魚體數量并稱重。計算存活率(survival rate，SR)和增重率(weight gain rate，WGR)：

存活率(%)=100×終末魚尾數/初始魚尾數；增重率(%)=100×[終末魚體總重(g)-初始魚體總重(g)]/初始魚體總重(g)。

1.8 數據分析

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當有顯著差異時，進行Tukey HSD多重性檢驗，比較組間的差異，數據以平均值±標準誤(mean±SE)表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 基因克隆和序列分析

珍珠龍膽石斑魚ZO-1的cDNA全長為6 355 bp，包括208 bp的5′-非翻譯區(UTR)，1 144 bp的3′-UTR；開放閱讀框(open reading frame，ORF)為5 106 bp，可編碼1 701個氨基酸；預測分析蛋白質分子質量為187.4 ku，等電點(pI)為5.92(圖1)。珍珠龍膽石斑魚Occludin的cDNA全長為2 222 bp，包括69 bp的5′-UTR，638 bp的3′-UTR；ORF為1 515 bp，可編碼504個氨基酸；預測分析蛋白質分子質量為55.8 ku，pI為5.60(圖2)。珍珠龍膽石斑魚Claudin-15a的cDNA全長為1 584 bp，包括387 bp的5′-UTR，528 bp的3′-UTR；ORF為669 bp，可編碼222個氨基酸；預測分析蛋白質分子質量為23.8 ku，pI為8.09(圖3)。

起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)用加粗字體表示，預測的磷酸化位點用下劃線表示。圖2、圖3同。

5個預測的跨膜區域用方框表示。

4個預測的跨膜區域用方框表示。

利用Signal P4.1軟件預測ZO-1、Occludin、Claudin-15a均不具有信號肽序列。蛋白質二級跨膜結構預測ZO-1無跨膜區域，Occludin有5個跨膜區域，Claudin-15a有4個跨膜區域。Net Phos 3.1軟件預測ZO-1共有208個磷酸化位點(分值大于0.5)，絲氨酸(serine)134處，蘇氨酸(threonine)44處，酪氨酸(tyrosine)30處；Occludin共有53個磷酸化位點，絲氨酸27處，蘇氨酸8處，酪氨酸18處；Claudin-15a共有30個磷酸化位點，絲氨酸10處，蘇氨酸12處，酪氨酸8處。完整的cDNA和推測的氨基酸序列已上傳NCBI數據庫，ZO-1、Occludin、Claudin-15a的GenBank登錄號分別為MK809396、MK809395、MK809394。

2.2 氨基酸序列比對與系統發育分析

根據NCBI的Blastp和DNAMAN Package 6.0軟件對珍珠龍膽石斑魚與其他物種的ZO-1氨基酸序列進行同源比對(圖4)。比對結果顯示，珍珠龍膽石斑魚ZO-1氨基酸序列與硬骨魚的同源性為87%～94%；與高體鰤(Serioladumerili)的同源性最高，為94%；與青鳉(Oryziaslatipes)的同源性也高達90%；與小鼠(Musmusculus)、獼猴(Macacamulatta)、非洲爪蟾(Xenopustropicalis)和雞(Gallusgallus)的同源性較低，為63%。系統發育樹分析表明(圖5)，珍珠龍膽石斑魚與硬骨魚的親緣關系較近，其中與高體鰤的親緣關系最近，與軟骨魚、哺乳類、兩棲類和鳥類的親緣關系較遠。

Homo sapiens：人；Mus musculus：小鼠；Macaca mulatta：獼猴；Capra hircus：山羊；Canis lupus familiaris：犬；Bos Taurus：牛；Gallus gallu：雞；Xenopus laevis：非洲爪蟾；Callorhinchus milii：葉吻銀鮫；Oncorhynchus mykiss：虹鱒；Takifugu flavidus：菊黃東方鲀；Danio rerio：斑馬魚；Oryzias latipes：青鳉；Seriola dumeril：高體；Hybrid grouper：珍珠龍膽石斑魚。下圖同 The same as below。

圖5 珍珠龍膽石斑魚ZO-1序列的系統發育樹

根據NCBI的Blastp和DNAMAN Package 6.0軟件對珍珠龍膽石斑魚與其他物種的Claudin-15a氨基酸序列進行同源比對(圖6)。比對結果顯示，珍珠龍膽石斑魚Claudin-15a氨基酸序列與硬骨魚的同源性為75%～92%；與環紋圓天竺鯛(Sphaeramiaorbicularis)相似度最高，為92%；與非洲爪蟾、短吻鱷(Alligatormississippiensis)、獼猴、牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)的同源性分別為58%、53%、54%、53%、54%；而與小鼠的同源性最低，為49%。系統發育樹分析表明(圖7)，珍珠龍膽石斑魚獨立成一支，再與其他魚類緊密匯成一支，說明珍珠龍膽石斑魚Claudin-15a與其他魚類同源性較高；珍珠龍膽石斑魚與人、獼猴、短吻鱷、非洲爪蟾同源性較低，與牛、小鼠的親緣關系較遠。

Alligator mississippiensis 短吻鱷；Ictalurus punctatus 斑點叉尾；Takifugu rubripes 紅鰭東方鲀；Oncorhynchus mykiss 虹鱒；Oncorhynchus kisutch 銀鮭；Sphaeramia orbicularis 環紋圓天竺鯛。圖7同 The same as Fig.7.

圖7 珍珠龍膽石斑魚Claudin-15a序列的系統發育樹

根據NCBI的Blastp和DNAMAN Package 6.0軟件對珍珠龍膽石斑魚與其他物種的Occludin氨基酸序列進行同源比對(圖8)。比對結果顯示，珍珠龍膽石斑魚Occludin氨基酸序列與大黃魚的同源性最高，為84%；其次是棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)，為81%；與虹鱒、青鳉、斑馬魚(Daniorerio)、葉吻銀鮫(Callorhinchusmilii)、非洲爪蟾、穴兔(Oryctolaguscuniculus)、獼猴、人、小鼠的同源性分別為67%、65%、61%、49%、49%、47%、47%、47%、46%；而與雞的同源性很低，僅有39%。系統發育樹分析表明(圖9)，珍珠龍膽石斑魚單獨為一枝；與大黃魚、棘頭梅童魚再匯為一枝，親緣關系最近，同源性較高；然后與其他魚類匯為一枝。珍珠龍膽石斑魚與非洲爪蟾、短吻鱷、雞以及哺乳動物的同源性較低。

Oryctolagus cuniculus 穴兔；Collichthys lucidus 棘頭梅童魚；Larimichthys crocea 大黃魚。圖9同 The same as Fig.9.

圖9 珍珠龍膽石斑魚Occludin序列的系統發育樹

2.3 ZO-1、Claudin-15a、Occludin在各組織的mRNA相對表達量

由圖10可知，ZO-1、Claudin-15a、Occludin在各組織中均有表達。后腸中ZO-1 mRNA相對表達量極顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是脾臟、前腸、中腸、皮膚中ZO-1 mRNA相對表達量較高，而腦、鰓、心臟、頭腎、胃、肝臟、肌肉、體腎中ZO-1 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)。前腸、中腸中Claudin-15amRNA相對表達量顯著高于其他各組織(P<0.05)；胃和體腎中Claudin-15amRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于腦、鰓、心臟、頭腎、脾臟、肝臟、肌肉和皮膚(P<0.05)。皮膚、前腸中OccludinmRNA相對表達量最高，其次為中腸和后腸，皮膚、前腸、中腸、后腸中OccludinmRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)；腦、心臟、頭腎、脾臟、胃、肝臟、肌肉、體腎中OccludinmRNA相對表達量較低，且顯著低于皮膚、前腸、中腸、后腸和鰓(P<0.05)。

數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.4 飼料精氨酸水平對珍珠龍膽石斑魚增重率、存活率的影響

由圖11可知，3.06%精氨酸水平組的增重率顯著高于1.96%和3.74%精氨酸水平組(P<0.05)，1.96%和3.74%精氨酸水平組之間無顯著差異(P>0.05)。各組之間存活率無顯著差異(P>0.05)。

圖11 飼料精氨酸水平對珍珠龍膽石斑魚增重率(A)和存活率(B)的影響

2.5 飼料精氨酸水平對珍珠龍膽石斑魚腸道緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

由圖12可知，3.06%精氨酸水平組腸道中ZO-1、Occludin、Claudin-15amRNA相對表達量顯著高于1.96%和3.74%精氨酸水平組(P<0.05)。3.74%精氨酸水平組腸道中ZO-1和OccludinmRNA相對表達量顯著高于1.96%精氨酸水平組(P<0.05)，1.96%和3.74%精氨酸水平組之間腸道中Claudin-15amRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖12 腸道中ZO-1、Occludin、Clauin-15a mRNA相對表達量

3 討 論

機體細胞生長和凋亡之間的不平衡以及緊密連接蛋白的改變容易引起黏膜屏障完整性的破壞，生存環境、飼料營養水平等的變化是導致該事件發生的主要誘因，掌握緊密連接蛋白的表達對調控機體健康至關重要。系統發育樹分析顯示，珍珠龍膽石斑魚ZO-1氨基酸序列與其他魚類比對結果在62%～94%，與高體鰤的親緣關系最為密切，與非洲爪蟾、人、小鼠和雞的比對結果在63%～64%，說明ZO-1基因保守性較高。珍珠龍膽石斑魚Occludin氨基酸序列與其他魚類比對結果在49%～84%，與大黃魚的親緣關系最密切。珍珠龍膽石斑魚Claudin-15a氨基酸序列與環紋圓天竺鯛比對結果相似度最高，達到92%，親緣關系最近，與其他硬骨魚類同源性也在75%以上，說明Claudin-15a基因在魚類中相似度比較高。

緊密連接蛋白能夠通過結合肌動蛋白細胞骨架維持黏膜組織完整性，是影響黏膜物理屏障功能和通透性的重要指標[17-18]。金魚(Carassiusauratus)暴露在低離子水中，鰓組織中鈉鉀泵(K+-Na+-ATP酶)活性迅速下降，Occludin基因表達短暫上調[19]。核黃素的缺乏會上調草魚幼魚鰓部Claudin-12和肌球蛋白輕鏈激酶的mRNA表達，下調Claudin-c、Claudin-3、Occludin和ZO-1的mRNA表達，破壞緊密連接屏障[20]。上調ZO-1、Occludin、Claudin-b、Claudin-c和Claudin-3c的mRNA表達和下調Claudin-12和Claudin-15的mRNA表達能夠提高草魚腸道細胞間的結構完整性[21]。本試驗中，緊密連接相關基因ZO-1、Claudin-15a、Occludin在珍珠龍膽石斑魚13種組織中均有分布，在腸道(前、中、后腸)組織中相對表達量都較高，提示這3個基因在維護腸道黏膜屏障中起著重要的作用。ZO-1在細胞間緊密連接中起著樞紐的作用，維系著Occludin蛋白和肌動蛋白骨架，在受到外界信號刺激下，完成收縮運動[22]，該基因在石斑魚脾臟中的相對表達量較高。頭腎和脾臟作為魚類免疫器官和黏膜免疫屏障，其結構的完整性是保障免疫功能正常工作的基礎[23]，推斷ZO-1基因有可能參與保護石斑魚脾臟細胞間的結構完整性，維持魚體健康。Claudin蛋白作為胃上皮細胞連接相關的重要蛋白，其異常表達可能會導致胃黏膜屏障出現損傷[24-26]，這也與本試驗中Claudin-15a在胃組織中mRNA相對表達量較高的結果符合，說明Claudin-15a可能參與保護石斑魚胃黏膜屏障。當前對Claudin-15a基因的研究較少，可能與損傷后的滲透性改變相關[27]。Occludin基因在石斑魚組織中廣泛表達，在皮膚和鰓中mRNA相對表達量較高，這與Chasiotis等[28]發現金魚鰓和皮膚中OccludinmRNA相對表達量較高的試驗結果一致。Occludin蛋白作為緊密連接跨膜蛋白，對保護緊密連接屏障和跨上皮細胞旁通路的通透性有顯著貢獻[29]，在維持虹鱒水鹽平衡相關的器官如腸道、皮膚、鰓中mRNA相對表達量高，在頭腎和脾臟中mRNA相對表達量較低[30]；也可能因為Occludin基因在這2個組織中mRNA相對表達量低，導致維生素C對中期草魚頭腎和脾臟中Occludin基因調控無顯著影響[31]。

機體腸道健康與腸道物理屏障和緊密連接蛋白表達相關[32-33]。下調腸道緊密連接蛋白Claudin、ZO-1和Occludin的mRNA表達，會影響腸道形態及屏障功能，導致機體生長發育速度變緩[34-35]，上調十二指腸、空腸以及回腸ZO-1和Occludin的mRNA表達，可促進細胞間緊密連接結構的形成，增強仔豬小腸黏膜的屏障功能[36]。本課題組前期研究表明，7個精氨酸水平中，當飼料精氨酸水平為2.95%時，斜帶石斑魚生長和腸道發育情況最好，對腸道細胞的增殖分化和細胞形態具有保護作用，有利于提高石斑魚皺襞高度，增大腸道吸收面積，通過二元擬合得知3.06%精氨酸水平是該規格石斑魚最適精氨酸需求量；低或高水平精氨酸導致斜帶石斑魚前、中、后3個腸段的皺襞高度降低，肌層厚度變薄[14，37]。本試驗中，精氨酸缺乏組(1.96%精氨酸水平組)和過量組(3.74%精氨酸水平組)增重率下降，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-15a的mRNA相對表達量均較低；當珍珠龍膽石斑魚攝食含適宜水平精氨酸的飼料后，腸道緊密連接蛋白的mRNA表達顯著上調，魚體增重率顯著提高，進一步表明精氨酸可通過上調緊密連接蛋白的mRNA表達，保護腸道黏膜屏障，促進魚體的健康生長。飼料配方中精氨酸的有效含量可以改善魚體腸道黏膜健康狀態，為后續石斑魚營養素需求、飼料配制及健康生長的研究提供了基礎。

4 結 論

① 本研究通過同源克隆及RACE-PCR技術克隆獲得了珍珠龍膽石斑魚ZO-1、Claudin-15a、Occludin的cDNA序列長度，提交到NCBI GenBank數據庫，登錄號分別為MK809396、MK809394、MK809395。

②ZO-1、Occludin和Claudin-15a在雜交石斑魚13種組織中均有表達，mRNA相對表達量最高的組織分別為后腸、中腸和皮膚。

③ 飼料適宜精氨酸水平可顯著上調珍珠龍膽石斑魚腸道ZO-1、Occludin、Claudin-15amRNA相對表達量，維護腸道黏膜屏障完整，促進魚健康生長。