左旋肌肽對中華田園犬生長和健康的影響

陳雪薇 李 揚 秦順義 楊 華 張建斌

(天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384)

隨著我國經濟實力的提升和人們現代消費觀念的更新，以及人口結構老齡化問題的加劇，導致我國飼養寵物的家庭不斷增長，促進了寵物行業的高速發展，預計2022年寵物食品市場規模將突破千億[1]。犬是各種寵物食品行業發展的基礎品種[2]，犬糧的生產不僅是為了滿足犬類基礎的生長發育需要，也要為犬類提供富含營養并促進健康的成分。近年來，我國寵物食品企業從原料選擇、研發生產到品質控制發展迅速，越來越接近國際化標準[3]。但是在犬飼養過程中，經常會由于飼養管理不當、飼糧營養供給過多或不足引起犬的營養性代謝疾病發生。因此，在日常生活中必須根據其處于不同生理階段的營養需要，進行科學喂養，提升犬的免疫力，避免發生營養性代謝疾病，保證其健康生長。

左旋肌肽(L-carnosine)是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成，是廣泛存在于多種脊椎動物骨骼肌和大腦中的內源性二肽[4]。左旋肌肽可以有效清除自由基，提高機體抗氧化能力；可以與體內的活性物質反應，保護蛋白質不被糖基化，同時左旋肌肽可以與已經發生糖基化的蛋白質產物作用，阻止糖基化蛋白質的進一步交聯[5]，改善腦組織的能量代謝[6]，治療或預防蛋白質穩態受損導致的疾病[7]；還具有抑制谷氨酸誘導細胞凋亡的能力[8]，有效保證肝臟和腎臟的生理功能[9]，還有改善大鼠代謝綜合征的作用[10]。基于肌肽的良好應用前景，世界各國的科研機構對肌肽的研究投入也在逐年增長，我國目前對于左旋肌肽提取工藝的研究已較成熟，但對于左旋肌肽的成分分析、在動物機體內的生化代謝機理仍需進一步研究[11]。目前關于左旋肌肽的研究大多數局限于醫學疾病領域研究，在寵物飼糧方面的實際應用亦較為罕見。因此，本試驗旨在通過犬糧中添加左旋肌肽，研究其對中華田園犬生長性能、血清生化指標及抗氧化能力、消化代謝等的影響，從而為進一步了解左旋肌肽的生理功能及藥理作用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選用24只3月齡、相同飼喂水平的健康中華田園犬(購于楊柳青寵物貿易市場)，其中8只雄性，16只雌性，體重為(3.68±1.03)kg。按照性別和體重將24只中華田園犬隨機分為4組，每組6只犬(雄犬2只，雌犬4只)，每組6個重復，每個重復1只。對照組(C組)飼喂基礎飼糧，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組飼喂在基礎飼糧中分別添加300、600和900 mg/kg左旋肌肽的試驗飼糧。預試期7 d，各組犬均統一飼喂基礎飼糧(全價飼糧)，使其適應本試驗所配制的飼糧。正試期28 d，

1.2 試驗飼糧

按照美國飼料管理協會(AAFCO)以及GB/T 31216—2014中幼犬營養需要標準，科學配制基礎飼糧，其組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 飼養管理

中華田園犬飼養于天津農學院西校區實驗動物中心。試驗開始之前，先對圈舍內柵欄、地面及喂食飲水器具進行清洗消毒，采用甲醛-高錳酸鉀熏蒸法對整個圈舍進行48 h封閉消毒處理。每天08:30、13:20、18:00定時飼喂，自由飲水；每天打掃舍內衛生，清理籠內糞便，每隔2 d用高壓水槍沖洗整個圈舍，保持舍內干凈衛生，所有的中華田園犬均進行正常免疫程序。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 生長性能測定

對中華田園犬采食不限量。每天記錄各組的采食量，并計算平均日采食量。計算公式如下：

平均日采食量=每組中華田園犬總采食量/(每組中華田園犬×試驗總天數)。

在正試期第0(試驗當天)、7、14、21、28天為每只中華田園犬稱量體重并計算中華田園犬的平均日增重。計算公式如下：

平均日增重=(終末總體重-初始總體重)/(試驗天數×試驗只數)。

料重比計算公式如下：

料重比=消耗飼糧總重/增重總量。

1.4.2 感官評價標準

由5位測評人員對中華田園犬進行感觀評定，參照犬只等級評定及犬屬性等級判斷標準制定出中華田園犬感官評分標準，見表2。

表2 中華田園犬感觀評價標準

1.4.3 糞便質量評價

糞便采集分別在正試期的第24～28天的上午投食完后進行。對采集完新鮮糞便進行拍照保存(圖1)，再根據WALTHAMTM犬糞便評分體系(The WALTHAMTM Faeces Scoring System[13])的標準對中華田園犬的糞便進行質量評定。

C：對照組 control group; Ⅰ:Ⅰ組 group Ⅰ;Ⅱ:Ⅱ組 group Ⅱ;Ⅲ:Ⅲ組 group Ⅲ。

1.4.4 養分表觀消化率測定

在正試期第24～27天上午喂食后，收集每組中華田園犬2 h內的新鮮糞便，而后立即放入-20 ℃冰箱內保存，將這4 d收集的糞便每組混勻后放入65 ℃烘箱烘干，用粉碎機將烘干后的樣品粉碎，測定干物質(GB/T 6435—2014)、粗蛋白質(GB/T 6432—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗灰分(GB/T 6438—2007)、鈣(GB/T 6436—2018)、磷(GB/T 6437—2018)含量，再采用內源指示劑法(鹽酸不溶灰分作指示劑)測定養分表觀消化率。計算公式如下：

養分表觀消化率(%)=100×[100-(b×c)/(a×d)]。

式中：a為飼糧中某元素含量(%)；b為糞中相應元素含量(%)；c為飼糧中鹽酸不溶灰分含量(%)；d為糞中鹽酸不溶灰分含量(%)。

1.4.5D-木糖吸收試驗

在正試期第28天，中華田園犬空腹12 h后按照每千克體重灌服10%D-木糖溶液5 mL，1 h后前肢靜脈采血3 mL，37 ℃恒溫放置15 min后，4 000×g離心10 min，分離全血取上清液，測定各組血清中D-木糖含量。

1.4.6 血清生化指標測定

在正試期第28天，對中華田園犬前肢靜脈采血，采血前禁食12 h。采用前肢靜脈采血法，采血5 mL，37 ℃恒溫放置15 min，離心10 min(4 000×g)分離血清，然后將血清放在-80 ℃的冰箱里保存，備用。使用全自動血液生化分析儀測定血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)活性及肌酐(CRE)、尿素(Urea)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量。

1.4.7 血清免疫球蛋白含量測定

取前述采集的血清，采用英科新創(廈門)科技股份有限公司提供的試劑盒測定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量，嚴格按照說明書進行操作。

1.4.8 血清抗氧化能力指標測定

取前述采集的血清，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定血清中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，嚴格按照說明書進行操作。

1.5 數據處理與分析

數據采用“平均值±標準誤”表示，經Excel 2010整理后，使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，同時采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 左旋肌肽對中華田園犬生長性能和感官評定的影響

2.1.1 左旋肌肽對中華田園犬生長性能的影響

由表3可知，平均日增重和平均日采食量都與左旋肌肽添加量成反比，C組的平均日增重及平均日采食量均顯著高于Ⅱ組、Ⅲ組(P<0.05)。

表3 左旋肌肽對中華田園犬生長性能影響

2.1.2 左旋肌肽對中華田園犬感官評定的影響

感官評價可以直接觀察中華田園犬的健康情況以及它們的精神狀態，根據5位測評人員的評分平均值得到中華田園犬的感官評分圖(圖2)。得到的總評分在25.5～35.0分，隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，各項評分值也逐漸升高，Ⅲ組的各項評分值均高于其他組，在皮膚狀態、鼻子濕潤程度和靈活度方面尤為突出。

圖2 左旋肌肽對中華田園犬感官評分的影響

2.2 左旋肌肽對中華田園犬腸道消化吸收功能的影響

2.2.1 左旋肌肽對中華田園犬糞便評分的影響

The WALTHAMTM糞便評分系統將糞便性狀劃分為9個級別。其中1級表示糞便最為干、硬，5級表示糞便最稀。理想的糞便是1.5～2.5級(含2.5級)，較差的糞便是小于1.5級或大于3.5級(不含3.5級)，將2.5級視為最佳糞便評分。由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組以及C組的糞便評級圖(圖3)和評分表(表4)可知，各組評分在1.5～3.5級，均處于健康水平，Ⅰ、Ⅲ組中華田園犬糞便評分值顯著高于C組(P<0.05)，其中Ⅱ組評分值與最佳糞便評分最為接近。

圖3 左旋肌肽對中華田園犬糞便評分的影響

表4 左旋肌肽對中華田園犬糞便評分的影響

2.2.2 左旋肌肽對中華田園犬養分表觀消化率的影響

由表5可知，各組粗脂肪表觀消化率隨著左旋肌肽添加量的增加而升高，Ⅲ組的粗脂肪表觀消化率顯著高于C組(P<0.05)；Ⅱ、Ⅲ組對粗蛋白質和粗纖維表觀消化率顯著高于C組(P<0.05)；鈣、磷表觀消化率在各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表5 左旋肌肽對中華田園犬養分表觀消化率的影響

2.2.3 左旋肌肽對中華田園犬血清D-木糖吸收的影響

由表6可知，隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，中華田園犬血清中D-木糖的含量呈上升趨勢，但各組血清中D-木糖含量差異均不顯著(P>0.05)。

表6 左旋肌肽對中華田園犬血清中D-木糖含量的影響

2.3 左旋肌肽對中華田園犬血清生化指標的影響

由表7可知，不同左旋肌肽添加量對各組血清TP、TG含量影響不顯著(P>0.05)。C組血清CHO、CRE含量顯著高于其他組(P<0.05)。C組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清ALT活性無顯著差異(P>0.05)；Ⅰ組血清AST活性顯著高于其他組(P<0.05)；Ⅱ組血清ALB含量顯著高于其他組(P<0.05)；Ⅲ組血清CRE含量相比其他組顯著降低(P<0.05)，但血清中Urea含量顯著高于C組(P<0.05)。

表7 左旋肌肽對中華田園犬血清生化指標的影響

2.4 左旋肌肽對中華田園血清免疫球蛋白含量的影響

由表8可知，C組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清中免疫球蛋白M含量無顯著差異(P>0.05)；Ⅱ組血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G含量顯著高于C組和Ⅰ組(P<0.05)。

表8 左旋肌肽對中華田園犬血清免疫球蛋白含量的影響

2.5 左旋肌肽對中華田園犬血清抗氧化能力的影響

由表9可知，隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，血清中T-AOC及GSH-Px、SOD活性顯著提高，其中Ⅱ、Ⅲ組顯著高于C組(P<0.05)。隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，血清中MDA的含量不斷下降，當左旋肌肽添加量為900 mg/kg時，MDA含量才顯著低于C組(P<0.05)。

表9 不同濃度左旋肌肽對中華田園犬血清抗氧化能力的影響

3 討 論

3.1 左旋肌肽對中華田園犬生長性能及感官評定的影響

本試驗通過平均日增重、平均日采食量和料重比來反映左旋肌肽對中華田園犬生長性能的影響。本研究表明，隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，中華田園犬的平均日采食量和平均日增重均顯著降低，但都保持在正常范圍內。高添加量左旋肌肽對生長的抑制作用可能是因為其添加后能激發機體功能亢進，進而抑制增重，另外是否有其他原因還有待進一步研究。

感官評定能較直觀地評估中華田園犬的健康狀況，通過對中華田園犬的毛發順滑程度、掉毛程度、皮膚狀態等方面的評估，可以直接判斷中華田園犬生病與否，精神狀態是否欠佳。受到各種外界因素的影響，動物機體內會不斷地產生自由基，從而導致皮膚衰老，左旋肌肽能夠清除自由基及一些氧化產物，起到抗皮膚衰老作用[5]。中華田園犬的最佳健康狀況為各項滿分即總分為40分的情況，本研究發現感官評分與左旋肌肽添加量呈正相關，表明左旋肌肽可以有效增強中華田園犬的精神狀態，還能使皮膚變得光滑有彈性，說明在犬糧里添加左旋肌肽在一定程度上改善了中華田園犬的感官性狀。

3.2 左旋肌肽對中華田園犬腸道消化吸收功能的影響

犬的糞便根據食物的種類、食物的供給量及消化功能狀態的不同而有所不同。觀察犬的糞便可以判斷很多疾病，尤其是對于消化道疾病及消化道功能狀態判定意義重大。糞便評定是反映小腸消化吸收效率最直觀的方法，通過分析中華田園犬糞便中的形態，可以了解中華田園犬的營養狀態。健康犬的糞便被稱為黃金栗子便，其外形圓潤、富有光澤、撿起來時不會粘在地板上，有一定的潤澤度[14]。根據WALTHAMTM糞便評分系統，將2.5級視為最佳的糞便評分。本研究通過采集犬不同時段的糞便，參照WALTHAMTM糞便評分系統的糞便評分圖，從糞便的形狀、顏色及成型度等方面進行對比，各組得到的評分都在1.5～3.0級，且試驗得到的糞便一般都為黃色或者褐色，屬于健康正常犬的糞便顏色。Ⅱ組的平均得分最接近于最佳的糞便評分2.5級，表明犬糧中添加600 mg/kg的左旋肌肽可增強中華田園犬小腸消化吸收功能。

D-木糖通常不會在血液中出現，口服后可在小腸被吸收，所以口服D-木糖后，在一定時間內血和尿中D-木糖含量基本上可以反映小腸吸收功能狀況[15]。本試驗結果表明，隨著左旋肌肽添加量的增加，中華田園犬血清中D-木糖的含量呈上升趨勢，可能的原因是左旋肌肽能對腸道起到保護作用，而且可能隨著添加量的增加會有更好的效果。同時本試驗結果還表明，在飼糧中添加一定水平的左旋肌肽能提高中華田園犬對粗蛋白質、粗脂肪及粗纖維表觀消化率，這些都說明添加左旋肌肽對中華田園犬的小腸消化吸收功能有所提高。

本試驗通過對犬糞便評分、表觀消化率及血清D-木糖含量進行測定，綜合反映了左旋肌肽對中華田園犬腸道消化吸收功能的影響，研究表明飼糧中添加600～900 mg/kg左旋肌肽可增強中華田園犬小腸消化吸收功能。

3.3 左旋肌肽對中華田園犬血清生化指標的影響

TP含量主要反映肝臟合成功能和腎臟病變造成蛋白質丟失的情況，通過TP含量檢測可間接了解機體的營養狀況。本研究表明，左旋肌肽對血清TP含量無顯著影響，表明飼糧中添加左旋肌肽可以有效保證肝臟和腎臟的生理功能。CHO和TG含量是反映機體脂肪沉積狀況的重要指標，有研究向小鼠的飲用水中添加左旋肌肽降低了血漿中CHO和TG含量，表明左旋肌肽可以顯著抑制脂肪酸合成酶活性[16]。本試驗測得血清CHO含量在正常范圍(3.9～7.8 mmol/L)，添加左旋肌肽顯著降低了血清中CHO的含量，對TG含量也有降低作用，但效果不明顯，表明左旋肌肽的添加可以有效幫助脂肪代謝，降低血清中總膽固醇的含量[9]。

ALT與AST都是肝臟細胞里的酵素，在肝細胞受損時才被釋放入血液，因此血清中ALT活性的高低可間接反映機體的肝功能狀況[17]。用血清AST、ALT活性與AST/ALT聯合檢測診斷急性肝炎的靈敏度和特異度均較高[18]。有研究表明，左旋肌肽能夠通過抗氧化和抑制致炎細胞因子的產生，保護肝臟不受損傷。王曉艷[9]的研究表明，左旋肌肽對血清ALT和AST活性影響均不顯著，與本試驗中左旋肌肽對血清ALT活性影響不顯著的結果一致，表明左旋肌肽的添加對肝臟功能無損傷作用。本試驗中測得血清ALT、AST活性均在正常范圍內(犬血清ALT活性正常范圍為4.0～66.0 U/L，AST活性正常范圍為0～50.0 U/L)。不過本試驗中添加300 mg/kg的左旋肌肽顯著提高了血清AST活性，原因可能是添加左旋肌肽劑量的不同以及動物種類差異導致。

CRE是腎功能檢查的特異性指標。Urea含量變化也能夠在一定程度上判斷機體腎功能的好壞。犬血清CRE含量正常范圍為44.0～120.0 μmol/L，Urea含量范圍為15.0～57.7 mg/dL。本試驗中各組血清CRE、Urea含量均在正常范圍內，但Ⅲ組血清CRE含量相比其他組顯著降低，說明添加左旋肌肽能夠在一定程度上改善腎功能。有研究表明，氧化應激損傷導致腎臟血流動力學異常改變，從而導致血清Urea含量升高，從而可以解釋本試驗中Ⅲ組血清Urea含量顯著高于C組的結果。

3.4 左旋肌肽對中華田園犬血清免疫球蛋白含量的影響

通過上述討論，表明飼糧中添加左旋肌肽可以明顯提高中華田園犬感官評價、糞便評分以及肝臟和腎臟的生理功能，并且顯著提高了機體的抗氧化能力，這些方面也能間接提高機體的免疫能力。免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M是機體內重要的非特異免疫因子，本試驗中添加左旋肌肽顯著提高血清中免疫球蛋白A和免疫球蛋白G的含量，可能是由于肌肽可以保護細胞免受自由基和活性氧所致的損傷，從而提高機體自身的免疫力[19]。

3.5 左旋肌肽對中華田園犬抗氧化能力的影響

T-AOC是一個全面反映皮膚組織抗氧化能力的良好指標[20]。GSH-Px是機體中重要的抗氧化酶，SOD能特異的清除超氧陰離子，與GSH-Px協同作用減少活性氧的產生，增強機體的抗氧化能力[21]。MDA是生物體內過氧化脂質的代謝產物，其含量的高低可反映組織細胞受自由基損傷的程度[20]。左旋肌肽能與MDA產生羰基反應，起到保護細胞的作用[17]。在女子足球運動員連續攝入L-肌肽28 d試驗[22]中，肌肽有降低谷胱甘肽(GSH)含量、GSH-Px、SOD活性，增強機體抗氧化作用，這與本試驗中隨著飼糧中左旋肌肽添加量的增加，Ⅱ組和Ⅲ組血清中GSH-Px、SOD活性及T-AOC升高的結果一致。邱玉朗等[23]的研究表明，肌肽顯著提高肉雞血清的T-AOC，還提高了肉雞血清中GSH-Px活性，降低了MDA含量，且機體抗氧化能力與肌肽添加量呈正相關。本試驗結果表明，飼糧中添加600及900 mg/kg左旋肌肽降低了中華田園犬血清中MDA含量，表明添加左旋肌肽可有效清除自由基，從而顯著提高了中華田園犬的抗氧化能力。

4 結 論

① 飼糧中添加600～900 mg/kg的左旋肌肽可使料重比得到一定改善，感官評分逐漸升高，表明添加左旋肌肽對于中華田園犬的健康狀態有一定積極作用。

② 飼糧中添加600 mg/kg的左旋肌肽可顯著提高中華田園犬的糞便評分，并對提高小腸吸收功能有顯著效果。

③ 飼糧中添加600～900 mg/kg的左旋肌肽可以提高中華田園犬的抗氧化能力及血清中部分免疫球蛋白含量。