血根堿對奶山羊生產性能、抗氧化和免疫功能的影響

凌 浩 肖紅艷 張紫陽 何幼寬 屈金濤，2 張佩華*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.城步羴牧牧業有限公司，邵陽 422500)

近年來，隨著生活水平的提高和對食品安全問題的重視，人們越來越關注抗生素在畜禽產品中的殘留問題。當前，世界各地已基本達成禁止在飼糧中添加促生長類抗生素的共識，我國已發布相關法令，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。為了畜牧業的可持續發展，保障食品安全和動物健康，開發利用綠色、安全、高效的飼用抗生素替代品已經成為當下畜牧研究的熱點與重要方向。血根堿(C20H14NO4)是一種從博落回等植物中提取出來的苯菲啶異喹啉類生物堿，提純固體呈紅黃色粉末狀，相對分子質量為332，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物學活性[1]。目前，血根堿在畜牧生產中的應用研究已有一定進展，國內外相關研究表明，飼糧中添加血根堿具有調節動物腸道功能、增強機體免疫和抗氧化能力、提高畜禽生產性能及改善畜產品質量等功效[2-6]。但是關于血根堿的應用研究大多數都是在單胃動物上進行，在反芻動物上的相關研究還鮮有報道，飼糧中添加血根堿能否提高奶山羊的生產性能、改善機體抗氧化和免疫功能還不清楚。因此，本研究擬在奶山羊飼糧中添加血根堿，探討其對奶山羊生產性能、抗氧化和免疫功能的影響，為血根堿在奶山羊上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年5月25日至2020年8月20日在湖南省邵陽市城步縣某奶山羊牧場進行。

1.2 試驗材料

血根堿制劑為博落回提取物，其活性成分為苯菲啶異喹啉類生物堿(血根堿含量≥0.15%)，由湖南某生物資源有限公司提供。

1.3 試驗設計

選擇24頭胎次[(2.4±0.3)胎]、泌乳日齡[(192±5)日齡]、產奶量[(1.55±0.12)kg]、體重[(54.96±3.48)kg]相近的西農薩能奶山羊，隨機分成2組，每組12頭。對照組飼喂全混合日糧，血根堿組飼喂全混合日糧+400 mg/kg血根堿。血根堿添加量參考Wang等[7]和Estrada-Angulo等[8]的試驗結果。試驗期52 d，其中預試期10 d，正試期42 d。

1.4 試驗飼糧

試驗飼糧參照NRC(2007)奶山羊標準進行設計，其組成及營養水平見表1。試驗采用全混合日糧飼喂方式。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.5 飼養管理

試驗羊采用小欄飼養，每組12頭，隨機分為4欄飼喂，每欄3頭。每天分別于08:00及16:30飼喂，保證每欄有5%剩料。每天分別于07:00及18:00擠奶。自由飲水和自由采食，消毒、免疫等按羊場常規程序進行。

1.6 樣品采集及指標測定

1.6.1 生產性能測定

正試期開始后，每天記錄每頭試驗羊的產奶量，用于測定平均日產奶量。

正試期以欄為單位每天記錄試驗羊的平均喂料量和剩料量，用于測定干物質采食量。飼料轉化率計算公式如下：

飼料轉化率=產奶量(kg/d)/干物質采食量(kg/d)[9]。

1.6.2 飼糧樣采集與測定

正試期每周采用四分法收集1次對照組和血根堿組飼糧樣和剩料樣各500 g，稱重后在65 ℃鼓風烘箱中烘48 h，測定初水分含量，測定后粉碎，過40目篩用于測定常規養分含量。參照GB/T 6435—2014的方法測定干物質(DM)含量，參照GB/T 6432—2018的方法測定粗蛋白質(CP)含量，參照GB/T 6433—2006的方法測定粗脂肪(EE)含量，參照GB/T 6438—2007的方法測定粗灰分(Ash)含量，參照GB/T 6436—2018的方法測定鈣(Ca)含量，參照GB/T 6437—2018的方法測定總磷(TP)含量，參照GB/T 6434—2006的方法測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.6.3 血樣采集與測定

正試期第21和42天晨飼前，使用一次性真空采血管進行頸靜脈采血，每頭羊采集血樣10 mL，其中5 mL注入普通真空采血管，離心(633×g，15 min)后，用移液槍取上清液并分裝到至1.5 mL離心管，-20 ℃冰箱保存，用于測定血清抗氧化和免疫指標。剩余5 mL注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管4 ℃保存，2 h內測定血細胞參數。

采用試劑盒法測定血清總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法測定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量。ELISA試劑盒購自江蘇雨桐生物科技有限公司。

使用全自動五分類血細胞分析儀(光電MEK-7222K，日本)測定血液白細胞(white blood cell，WBC)、中性粒細胞(neutrophil，NEUT)、淋巴細胞(lymphocyte，LYMPH)、單核細胞(monocytes，MONO)、嗜酸性細胞(oxyphil cell，EO)、嗜堿性細胞(basophil，BASA)、紅細胞(red blood cell，RBC)數量。

1.7 數據處理與分析

試驗數據使用Excel 2010進行初步整理后，利用SAS 9.4軟件進行統計學分析，統計結果用最小二乘法均值和均值標準誤(SEM)表示。生產性能數據進行正態分布檢驗后，使用獨立樣本t檢驗分析。

血液指標數據使用PROC MIXED模型進行數據統計分析，不同的采樣日期(第21天和第42天)測定結果視為重復，以試驗羊為隨機因素，試驗處理、采樣日期、試驗處理與采樣日期互作為固定因素。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

統計分析模型：Yijk=μ+Ti+Dj+Ti×Dj+Gk+εijk。

式中：Yijk為因變量；μ為總體均值；Ti為處理(i=1，2)，固定效應；Dj為采樣日期(j=21，42)，固定效應；Ti×Dj為處理和采樣日期的交互作用，固定效應；Gk(k=1,2,3,…,24)為試驗奶山羊，隨機效應；εijk為變量i、j、k的隨機誤差。

2 結 果

2.1 血根堿對奶山羊生產性能的影響

由表2可知，與對照組相比，血根堿組的產奶量顯著提高了8.3%(P<0.05)。2組之間干物質采食量和飼料轉化率無顯著差異(P>0.05)。

2.2 血根堿對奶山羊血清抗氧化指標的影響

由表3可知，血根堿組的血清MDA含量極顯著低于對照組(P<0.01)，血清GSH-Px活性和T-AOC極顯著高于對照組(P<0.01)。2組之間血清SOD活性無顯著差異(P>0.05)。

表3 血根堿對奶山羊血清抗氧化指標的影響

2.3 血根堿對奶山羊血細胞參數的影響

由表4可知，血根堿組的血液WBC數量顯著高于對照組(P<0.05)，血液NEUT數量極顯著高于對照組(P<0.01)。2組之間血液LYM、MONO、EO、BASO和RBC數量無顯著差異(P>0.05)。

表4 血根堿對奶山羊血細胞參數的影響

2.4 血根堿對奶山羊血清免疫指標的影響

由表5可知，血根堿組的血清IL-2和IgG含量顯著高于對照組(P<0.05)，血清IL-4和IgA含量極顯著高于對照組(P<0.01)。2組之間血清TNF-α、IL-6、IL-8和IgM含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 血根堿對奶山羊血清免疫指標的影響

3 討 論

3.1 血根堿對奶山羊生產性能的影響

血根堿作為一種綠色、安全、高效的飼用抗生素替代品，可以在動物體內分解代謝為無潛在危害的二氫血根堿(C21H17NO5)，并且在機體內不會被重新氧化成血根堿[10-11]，沒有耐藥性和殘留的風險，可在畜禽飼糧中長期添加。近年來，國內外已有較多研究表明，血根堿可以改善畜禽的生產性能。Abudabos等[5]研究發現，血根堿可以改善沙門氏菌感染的肉雞的生長性能和腸道健康。Liu等[6]研究發現，飼糧中添加血根堿可改善1～28日齡黃羽肉雞的腸道形態和微生物群落結構，從而提高其生長性能。Chen等[4]研究發現，血根堿可以作為抗生素的潛在替代品，對斷奶仔豬的生長性能、免疫狀況、抗氧化能力和腸道健康都有一定的促進作用。產奶量的變化可以有效反映奶畜的生產性能和健康狀況。在本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加血根堿能夠顯著提高奶山羊的產奶量，改善生產性能。其可能的原因是，血根堿具有抗炎和抗菌作用，能夠改善腸道形態和微生物群落結構[4-5,12]，提高生產性能；或者是血根堿可以增強機體的抗氧化和免疫功能[2,13-14]，保護腸道和乳腺的屏障功能，提高生產性能；也有可能是多種效果同時發揮作用，改善動物的生產性能。

3.2 血根堿對奶山羊抗氧化功能的影響

奶畜在泌乳期乳腺組織的營養代謝非常旺盛，容易產生較多的自由基，而過量的自由基會打破機體內的氧化動態平衡，導致細胞內蛋白質、脂質等大分子物質過氧化，造成氧化損傷[15]。T-AOC是反映機體抗氧化系統綜合能力的指標[16]；T-SOD和CSH-Px是機體清除自由基、對抗氧化應激、保護細胞膜結構和功能完整的特異性酶[17]；MDA是脂質過氧化代謝的終產物，能夠間接地反映細胞損傷的程度[18]。Bavarsadi等[19]研究發現，在蛋雞飼糧中添加血根堿可以降低血清MDA含量，提高機體抗氧化功能。張衛兵等[20]研究表明，在犢牛飼糧中添加血根堿具有改善犢牛機體抗氧化功能的效果。在本試驗中，飼糧中添加血根堿能夠極顯著降低奶山羊血清MDA含量，極顯著提高血清T-AOC和CSH-Px活性，改善機體抗氧化功能。可能的原因是血根堿通過抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶復合物的活性[21-22]，減少機體自由基的產生，從而發揮其抗氧化能力。

3.3 血根堿對奶山羊血細胞參數的影響

動物機體發揮正常的免疫功能需要保證免疫細胞結構和功能的完整，WBC是包括MONO、粒細胞和LYMPH在內的發揮非特異性免疫功能的血細胞[23]；NEUT具有運動和吞噬功能，發揮非特異性防御和保護作用，可以吞噬并殺滅入侵體內的細菌、病毒等異物，它在血液中占WBC總數的50%左右，其增加或減少會直接影響WBC數量的變化[24]。在本試驗中，2組奶山羊的血細胞參數均在正常范圍內[25]；且與對照組相比，血根堿組的WBC數量顯著增加，NEUT數量極顯著增加，由此推測飼糧中添加血根堿能一定程度上提高奶山羊的非特異性免疫功能。可能的原因是血根堿具有較好的免疫增強作用，能夠保護免疫細胞膜的結構和功能的完整，激活免疫細胞的相關功能[26]，同時結合本試驗中血清抗氧化和免疫指標發現，血根堿可以提高奶山羊的抗氧化功能，增加血清IL-2、IL-4、IgG和IgA含量，改善免疫功能，保護機體健康，但是具體作用機制還不清楚，需要進一步探究。

3.4 血根堿對奶山羊免疫功能的影響

白細胞介素是一種由多種細胞產生的與炎癥通路和免疫調節相關的生物活性物質[27]。IL-2具有促進LYMPH生長、增殖和分化，調節機體免疫應答和抗病毒等多種生物活性；IL-4可以刺激活化B細胞和T細胞，調節體液免疫[28]。在本試驗中，飼糧中添加血根堿可以顯著提高奶山羊血清IL-2含量，極顯著提高血清IL-4含量，改善奶山羊的免疫功能，保護機體健康。其原因可能是血根堿具有很強的抗炎活性，能夠抑制核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，發揮抗炎作用[19]。

免疫球蛋白是由B淋巴細胞增殖分化產生的免疫活性物質，主要包括IgA、IgM、IgG，能夠抵御細菌、病毒等病原體入侵，是體液免疫的重要組成部分[29]。目前，大多數研究表明，飼糧中添加血根堿可以提高機體免疫球蛋白含量，改善免疫功能[30-32]；但也有相關研究表明，飼糧中添加血根堿會產生免疫抑制，降低機體免疫球蛋白含量[20]。可能的原因是血根堿產品的添加量與有效活性成分含量不同使試驗結果產生差異，或者是試驗動物的種類、生理階段等不同導致試驗結論不一致。這提示血根堿是能替代抗生素應用于生產實踐的，但是要全面替代抗生素，在動物生產上大規模推廣應用，還需要進行大量完整、系統地研究，確定不同動物種類與生理階段的適宜添加方式與添加量。在本試驗中，飼糧中添加血根堿可以顯著提高血清IgG含量，極顯著提高血清IgA含量，對血清IgM含量無顯著影響。由此推測血根堿可以通過調節免疫球蛋白的分泌，增強奶山羊的體液免疫應答，提高免疫力，抵御外界病原體的入侵。

4 結 論

在本試驗條件下，飼糧中添加血根堿可以提高奶山羊產奶量，改善機體的抗氧化和免疫功能。