青海地區不同海拔高度牦牛乳微生物多樣性研究

馬 靜 王 迅 孫 璐* 劉書杰*

(1.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，西寧 810016)

牦牛主要分布于海拔3 000 m以上的青藏高原等高寒草原地區[1]。中國現有牦牛1 300萬頭，約占世界牦牛總數的92.8%[2]，是世界上牦牛最主要的種質資源庫和最大的牦牛畜產品生產基地。大部分牦牛生活在青藏高原超凈區，這種特殊的自然環境使牦牛乳中的蛋白質、干物質、脂肪及乳糖等營養物質的含量高于其他乳。牦牛乳是一種天然、獨特的濃縮乳，具有“高濃度、高比重、高含量”的特點，被譽為“乳中之王”，還被譽為“上帝賜與人類最接近完美的食品”[3]。

原料奶具有復雜的微生物生態系統，其中包含許多菌株。牛乳微生物對健康的潛在影響包括阻斷腸胃病原體、中和結腸中產生的食物誘變劑，增強免疫反應，降低血清膽固醇含量，預防結腸癌和肝性腦病，治愈腸道功能障礙、便秘以及消化性潰瘍[4]。人類膳食結構的改變增加了對乳制品的需求，生鮮乳的質量安全受到密切關注。食源性致病菌是引發食源性疾病的重要因素，牦牛乳極高的營養價值為各類微生物的生長提供了良好的介質，致病微生物的代謝產物對牦牛生鮮乳的質量起著重要作用[5]。對生鮮乳微生物結構和組成的研究在乳品質的把控中十分關鍵，牛乳中的致病菌和腐敗菌可反映母牛的健康狀況、生鮮乳的衛生狀況、儲存時間等重要指標[6]。曾學琴等[7]為了對引起奶牛乳房炎的病原菌進行溯源，通過高通量測序技術檢測了乳房炎奶牛和正常奶牛的乳頭擦拭子和牛乳中細菌的16S rRNA，結果發現，患病奶牛乳頭及牛乳微生物組成與健康奶牛乳頭及牛乳微生物組成存在差異。胡婕[8]通過比較Illumina MiSeq和IonS5TMXL 2個二代測序平臺對4 ℃冷藏、間隔6 d的原料乳微生物多樣性分析，發現原料乳冷藏過程中由于微生物的生長代謝會導致其腐敗變質。牛乳中有些微生物使得其風味更加理想，有些則會使其發生腐敗變質[9]。

微生物的組成由遺傳背景、宿主飲食、環境差異和溫度等多種因素決定，微生物在極端環境下經過長期的自然選擇，具備相對特殊的結構、機能以及遺傳特性，以應答相應的脅迫因子[10-12]。目前，對于青海地區不同海拔高度牦牛生鮮乳的研究大多集中在其脂肪酸組成及營養成分含量等方面[13-14]，但對于不同海拔高度牦牛乳微生物區系的組成及多樣性分析未見相關報道，因此對不同海拔高度牦牛乳微生物組成和多樣性進行研究十分必要。

微生物的傳統檢測方法主要有純培養法、計數法、血清檢測法、特定引物的PCR檢測法等，雖然這些檢測方法都有利于病原微生物的鑒定，但也存在局限性，很難對微生物進行全面檢測[15]。隨著科學技術的發展，高通量測序技術因不依靠傳統培養基方法而簡單高效，是研究復雜微生物結構組成的較好選擇。因此，本研究利用16S rDNA分析方法，基于Illumina Nova測序平臺對青海地區高寒草地類不同海拔高度牦牛乳微生物群落結構及其多樣性進行研究，旨在為進一步開發牦牛乳提供基礎參考。

1 材料與方法

1.1 采樣信息

選自然放牧狀態下全天候隨群放牧的體況、年齡、胎次基本一致的牦牛，以天然草場為主，不補充任何飼料。泌乳期的母牛和犢牛分開過夜，每天人工擠奶1～2次但不完全擠完，以便犢牛可以喝到奶。3個采樣點擠奶、采樣方法相同。本試驗于2019年7—8月，分別在青海省玉樹州的稱多縣(yak1)、海西州的天峻縣(yak2)、海南州的共和縣(yak3)，采集高寒草甸類的天然草場的泌乳中期4～5胎次的健康牦牛乳樣本，每個采樣點采集5個樣本。采樣點基本信息見表1。每份牦牛乳樣本約50 mL，取5 mL于無菌無酶凍存管中，液氮速凍，運回實驗室后儲存在-80 ℃冰箱備測。

表1 采樣點基本信息

1.2 儀器與設備

DCC體細胞檢測儀，利拉伐天津有限公司；超低溫(-80 ℃)冰箱，美國Thermo公司；Fresco21型高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Tprofessiona PCR儀，德國Biometral公司；Gel DOC XR凝膠成像系統、PowerPac Universal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽(20 cm×25 cm)，美國Bio-Rad公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 基因組總DNA提取及PCR擴增、測序

1.3.2 環境因子的獲取

3個采樣點的海拔高度等信息利用天寶Juno SA無線GPS記錄器定位獲得，在國家氣象科學數據中心(http://data.cma.cn/site/index.html)獲取采樣點年平均氣溫。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 測序數據處理

測序所得原始序列截去Barcode和引物序列后,使用FLASH(version 1.2.7)進行拼接獲得原始Tags數據，拼接得到的原始Tags數據經Qiime軟件(version 1.9.1,http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)質量控制后獲得高質量Tags(clean Tags)數據，通過與物種注釋數據庫(https://github.com/torognes/vsearch/)進行比對檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效Tags(effective Tags)數據。

1.4.2 微生物多樣性分析

基于有效數據進行操作分類單元(OTUs)聚類分析和物種分類分析。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Observed-species、Chao1、Shannon及Simpson指數，使用R軟件(Version 2.15.3)完成Alpha多樣性指數組間差異分析。

利用Mothur(version 1.30.1)計算Alpha多樣性指數。利用QIIME(version 1.17)計算Beta 多樣性距離矩陣。基于Bray-Curtis距離進行相似性分析(ANOSIM)，基于Unweighted UniFrac距離對不同海拔高度牦牛乳微生物進行主坐標分析(CoA)。對牦牛乳微生物組成進行差異判別分析(LEfSe)，再根據分類學組成對樣本按照不同的分類水平進行線性判別分析(LDA，閾值為4)，找出對樣本劃分產生顯著性影響的菌群。此外，基于海拔高度以及年平均氣溫等環境因子數據，分析產生差異的原因。

2 結果與分析

2.1 樣本測序結果及Alpha多樣性指數

基于Illumina Nova測序平臺測序，構建PCR-free文庫，然后進行雙末端(paired-end)測序。通過對Reads拼接，平均每個樣本測得90 459條Tags，經過質控平均得到76 843條有效數據，質控有效數據量達60 460，質控有效率達67.18%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到12 329個OTUs，然后對OTUs序列與Silva132數據庫進行物種注釋。注釋結果中，共有4 211個(34.16%)OTUs注釋到屬水平。

Alpha多樣性指數中的Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指數主要用于反映樣本中菌群的豐富度。由表2可知，不同采樣點牦牛乳樣本中Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指數均無顯著差異(P>0.05)，表明不同海拔高度牦牛乳中菌群的豐富度差異不顯著。

表2 Alpha多樣性指數

2.2 不同海拔高度牦牛乳微生物組成

2.2.1 物種Venn圖分析

如圖1所示，yak1牦牛乳中總的OTUs數為5 367個，yak2牦牛乳中總的OTUs數為7 212個，yak3牦牛乳中總的OTUs數為6 095個。重疊的部分表示3個采樣點牦牛乳中共有的OTUs數，為2 988個。沒有重疊的部分表示3個采樣點牦牛乳中所特有的OTUs數，其中yak1為1 183個，yak2為2 143個，yak3為1 192個。yak1與yak2重疊的OTUs數為3 669個，yak1與yak3重疊的OTUs數為3 503個，yak2與yak3有4 388個OTUs重疊在一起。

圖1 基于OTUs的Venn圖

2.2.2 門水平下微生物組成

圖2顯示，不同海拔高度牦牛乳樣本中排名前10的菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸酐菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。3個采樣點的15個樣本中均有分布且相對豐度較高的菌門為變形菌門和厚壁菌門，這2個菌門在yak1牦牛乳中分別占細菌總序列的44.49%和20.93%，在yak2牦牛乳中分別占細菌總序列的39.30%和32.66%，在yak3牦牛乳中分別占細菌總序列的41.32%和23.90%。由此可知，變形菌門和厚壁菌門為3個海拔高度牦牛乳中的優勢菌門，變形菌門在海拔最高、年平均氣溫最低的稱多縣歇武鎮歇武村牦牛乳中占比最高，在海拔和年平均氣溫適中的天峻縣織合瑪鄉牦牛乳中占比最低。厚壁菌門的占比變化與變形菌門恰好相反，即海拔最高、年平均氣溫最低的稱多縣歇武鎮歇武村牦牛乳中厚壁菌門的占比最低，海拔和年平均氣溫適中的天峻縣織合瑪鄉牦牛乳中厚壁菌門的占比最高。

Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍藻門；Planctomycetes：浮霉菌門；Acidobacteria：酸酐菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Others：其他。

2.2.3 屬水平下微生物組成

圖3顯示，不同海拔高度牦牛乳樣本中排名前10的菌屬為同棲水菌屬(Enhydrobacter)、藍藻門未定義菌屬(unidentified_Cyanobacteria)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、馬賽菌屬(Massilia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌科未定義菌屬(unidentified_Enterobacteriaceae)、棒桿菌科未定義菌屬(unidentified_Corynebacteriaceae)、科薩克氏菌屬(Kosakonia)、肉桿菌屬(Atopostipes)。其中不動桿菌屬為yak1(海拔最高、年平均氣溫最低)和yak3(海拔最低、年平均氣溫最高)牦牛乳中的優勢菌屬，分別占細菌總序列的8.29%和7.71%，乳桿菌屬為yak2牦牛乳中相對豐度較高的菌屬，占細菌總序列的8.20%。未分類菌屬在yak1、yak2和yak3牦牛乳中的占比分別為68.44%、67.99%、73.22%。

Enhydrobacter：同棲水菌屬；unidentified_Cyanobacteria：藍藻門未定義菌屬；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Massilia：馬賽菌屬；Acinetobacter：不動桿菌屬；unidentified_Enterobacteriaceae：腸桿菌科未定義菌屬；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Atopostipes：肉桿菌屬；Others：其他。

熱圖(heat map)可呈現出樣本群落物種組成信息，反映每個分類級別的不同分組或樣本群落組成的相似性和差異性。圖4中，豐度較高的菌屬以紅色顯示，豐度較低的菌屬以藍色表示。在門水平上，所有樣本在左側物種聚類分支上分為七大支，分別為放線菌門、擬桿菌門、藍藻門、厚壁菌門、浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門。在屬水平上，yak1牦牛乳中中金黃桿菌屬、Lutibacter、紅小梨形菌屬(Rhodopirellula)、Persicirhabdus的豐度較高；yak2牦牛乳中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、水棲菌屬(Enhydrobacter)、馬賽菌屬的豐度較高；yak3牦牛乳中貪銅菌屬(Cupriavidus)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、動性球菌屬(Planococcus)的豐度較高。

Cupriavidus：貪銅菌屬；Microbacterium：微桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Planococcus：動性球菌屬；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Bergeyella：伯杰菌屬；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Moraxella：莫拉菌屬；Bradyrhizobium：慢生根瘤菌屬；Ralstonia：勞爾氏菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Sphingomonas：鞘氨醇單胞菌屬；Acinetobacter：不動桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；unidentified_Lachnospiraceae：毛螺菌科未定義菌屬；Arsenophonus：殺雄菌屬；Enhydrobacter：水棲菌屬；Lactobaillus：乳桿菌屬；Massilia：馬賽菌屬；Gardnerella：加德納氏菌屬；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；Rhodopirellula：紅小梨形菌屬；unidentified_Cyanobacteria：藍藻門未定義菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Psychrobacter：嗜冷桿菌屬；Phylum：門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Cyanobacteria：藍藻門；Firmicutes：厚壁菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門。

2.2.4 種水平下微生物組成

由表3可知，奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella_osloensis)、魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)和Kosakonia_oryzae為不同海拔高度牦牛乳樣本中所共有的微生物，但它們在3個采樣點牦牛乳中的相對豐度各不相同。奧斯陸莫拉氏菌為yak2牦牛乳中的優勢菌種，相對豐度為7.50%；魯氏不動桿菌為yak1牦牛乳中的優勢菌種，相對豐度為3.98%；Kosakonia_oryzae為yak3牦牛乳中的優勢菌屬，相對豐度為5.78%。

表3 種水平下牦牛乳微生物的相對豐度

2.2.5 物種PCoA

PCoA結果如圖5所示，第1主成分對樣本差異的貢獻值為14.37%，第2主成分對樣本差異的貢獻值為11.37%。yak2和yak3樣本距離較近而離yak1樣本距離較遠，由此可知，yak2和yak3樣本的群落結構相似度較高，而與yak1樣本的群落差異較大。這可能是由于天峻縣織合瑪鄉與共和縣黑馬河鄉之間的距離與稱多縣歇武鎮歇武村相比較近，地理環境相似。且天峻縣織合瑪鄉與共和縣黑馬河鄉之間海拔高度差距與稱多縣歇武鎮歇武村相比較小。由此推測，微生物群落結構相似度與地理環境與海拔高度有關。

圖5 基于Unweighted UniFrac距離的PCoA

2.3 不同海拔高度牦牛乳中微生物組成差異分析

yak1和yak3的海拔高度相差1 409 m，差距明顯，因此選取這2個采樣點進行不同海拔高度牦牛乳中微生物組成分析。線性判別分析(LDA)值分布柱狀圖(圖6-A)及進化分支圖(圖6-B)中體現了不同海拔高度牦牛乳間具有統計學差異的生物標志物(biomarker)和差異顯著的物種。由此可知，yak1牦牛乳中主要影響微生物組成的差異物種為放線菌門和放線菌門未定義菌綱(unidentified_Actinobacteria)，yak3牦牛乳中主要影響微生物組成的差異物種為黃桿菌目(Flavobacteriales)、擬桿菌綱(Bacteroidia)。

A：LDA值分布柱狀圖 LDA score distribution histogram；B：進化分支圖 evolutionary branch diagram。p：門 phylum；c：綱 class；o：目 order；f：科 family；g：屬genus；s：種 species。Actinobacteria：放線菌門；unidentified_Actinobacteria：放線菌門未定義菌綱；Corynebacteriales：棒桿菌目；Corynebacteriaceae：棒桿菌科；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Micrococcales：微球菌目；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Rhodobacterales：紅桿菌目；Rhodobacteraceae：紅桿菌科；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；unidentified_Flavobacteriales：黃桿菌目未定義菌科；Bacteroidetes：擬桿菌門；Bacteroidia：擬桿菌綱；Flavobacteriales：黃桿菌目。

3 討 論

牦牛乳是青藏高原區域游牧民族日常必需品，也是引起許多食源性疾病的主要來源。對不同海拔高度牦牛乳微生物多樣性的研究發現，青海地區牦牛乳中厚壁菌門和變形菌門為優勢菌門，優勢菌屬為不動桿菌屬和乳桿菌屬，這與現有的研究結果[18-19]基本一致。

微生物的多樣性不僅受到動物的影響，還與環境密切相關，高海拔生態系統通常具有氣溫低、降水量低、大氣壓力低的特征，這對微生物的多樣性有重大影響[20-21]。因此，海拔高度及氣溫差異可能是門、屬、科水平牦牛乳微生物組成差異的主要原因。不同海拔高度的牧草的營養成分含量及生物量存在差異。高利娥[22]的研究結果顯示，不同海拔高度的傳統發酵牦牛乳中乳酸菌的多樣性不同。微生物群落非常復雜，隨氣溫變化而變化，氣溫在微生物種群中起著至關重要的作用，高氣溫更有利于微生物的繁殖[23]。在海拔相對較低、氣溫相對較高的共和縣黑馬河牦牛乳中乳桿菌屬的占比最高，且該采樣點牦牛乳在門、屬、科水平下未分類的微生物占比最高。乳桿菌屬是乳酸菌群中的主要菌屬，是調節人體腸道菌群并使其保持正常狀態的重要細菌類群，在機體內可將糖轉化為乳酸，利于發酵活性的維持，多數乳桿菌屬被用作益生菌[24-25]。海拔越高，則微生物多樣性越小，且極端溫度也與微生物活性和新陳代謝的降低有關[26]。海拔高度和氣溫呈負相關，由此推測海拔較低、氣溫較高的地區的可能更有利于提高牦牛乳中乳桿菌屬的占比，有利于機體胃腸疾病的改善，是牦牛乳發酵制品更理想的原料乳。

變形菌門在海拔高度為4 781 m的yak1牦牛乳中占比最高，厚壁菌門在海拔高度為3 984 m的yak2牦牛乳中占比最高。變形菌門包括一些致病菌，如奈瑟氏屬、耶爾森氏屬和博爾塔氏屬、農桿菌屬、根瘤菌屬和大腸桿菌屬等[27]。有研究表明，γ-變形桿菌門尤其是腸桿菌科在未成熟的小鼠腸道大量存在，與早期腸道炎癥有關，不利于犢牛早期腸道微生物的定植[28-29]。變形菌門占比最高yak1牦牛乳可能更容易使腸道細菌在犢牛腸道定植，從而引起犢牛及飲用者的腹瀉和腸道炎癥。在屬水平上，作為優勢菌屬的不動桿菌屬，雖然在一些研究人員看來其產生的蛋白質水解酶和脂解酶可能有助于改善乳制品的風味、氣味或質地[30]，但Gurung等[31]和Dijkshoorn等[32]認為不動桿菌屬具有致病性，是被低估的食源性病原體[33]。并且，不動桿菌屬是原料乳中常見的嗜冷菌，若大量繁殖會破壞乳成分，導致腐敗變質，從而影響牛乳品質[34-35]。yak1牦牛乳中嗜冷菌占比最高的原因可能是該采樣點是3個采樣點中海拔最高、氣溫最低的。一般原料乳中不存在致病菌，而該乳中存在致病菌可能是因為牧民手工擠乳過程中被污染。本試驗中各采樣點均為牧民手工擠乳，這個過程中牛奶多次接觸空氣，空氣中的各種細菌、灰塵、雜物等必然污染牛奶[36]。目前未加工食品是食源性疾病患病率不斷上升的主要原因之一，如果原料乳中存在人畜共患病原體，則可能對公眾健康造成威脅，需盡量避免致病菌的附著。因此，應規范牦牛的飼養管理，重視畜舍衛生，生鮮牦牛乳應嚴格按照生產規范，盡量實現牦牛乳的機械化擠乳，做好殺菌消毒等工作，避免因生鮮乳引起的食源性疾病，提高原料乳的品質及安全性。

4 結 論

青海地區不同海拔高度牦牛乳中微生物組成和豐度存在差異。yak2和yak3牦牛乳中微生物群落結構相似度較高，并與yak1牦牛乳中微生物群落結構均存在較大差異。