抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對肉仔雞生長性能、腸道形態以及盲腸微生物區系的影響

朱隨亮 李 玥 鄭 旭 張靜靜 王世瓊 張 薇 譚 靜 王逢久 喬英英 劉長忠 王志祥*

(1.河南農業大學動物科技學院，鄭州 450002；2.河南加旺生物科技有限公司，鄭州 450002；3.河南科技學院，新鄉 453000)

隨著抗生素在畜產品中的殘留、耐藥菌株的產生及過量排泄造成環境的污染等問題[1]日益嚴峻，國家農業農村部發布194號公告，規定自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[2]。在抗生素禁用的情況下，尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品已成為研究熱點。抗菌肽(AP)是一類具有廣譜抗菌活性的多肽類物質，可以增強動物抗病力和免疫功能，提高畜禽生產性能，改善畜禽腸道組織結構，促進腸道動態的菌群平衡[3]。苯甲酸是酸化劑(AC)中的一種，研究發現酸化劑的使用對肉仔雞的生長和飼料轉化率[4]、養分利用[5]、腸道形態計量指數[4]和微生物群活性[6]有積極影響。功能性寡糖(FOS)具有抑制病原菌繁殖、增強畜禽免疫功能、改善腸道健康等功效，能夠提高畜禽生產性能[7]。目前，抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖作為單一的添加劑在肉仔雞飼糧中的應用研究報道較多，但對于抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合使用的研究較少。因此，本試驗選用抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加作為抗生素替代品，評價其對肉仔雞的生長性能、血清免疫指標、腸道形態以及盲腸微生物區系的影響，為抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖在肉仔雞生產中的聯合應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

抗菌肽、酸化劑、功能性寡糖和抗生素均為市售商品，由河南某生物科技有限公司提供。抗菌肽成分為抗菌多肽APSH-07及其他代謝產物(多肽、小肽、乳酸和氨基酸等)，其中APSH-07≥1%；酸化劑有效成分為苯甲酸≥40%，水分≤10%；功能性寡糖為酵母寡糖；抗生素為土霉素鈣(以50 mg/kg土霉素有效成分計)。

試驗選取1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞720只，隨機分為6組，每組6個重復，每個重復20只(公母各占1/2)，各重復體重接近。對照組(NC組)飼喂基礎飼糧，抗生素組(AN組)在基礎飼糧中添加500 mg/kg土霉素鈣，試驗組分別在基礎飼糧中添加300 mg/kg抗菌肽+200 mg/kg功能性寡糖(AP+FOS組)、300 mg/kg抗菌肽+350 mg/kg酸化劑(AP+AC組)、350 mg/kg酸化劑+200 mg/kg功能性寡糖(AC+FOS組)及300 mg/kg抗菌肽+350 mg/kg酸化劑+200 mg/kg功能性寡糖(AP+AC+FOS組)。試驗期42 d。

1.2 基礎飼糧和飼養管理

基礎飼糧參照NRC(1994)肉仔雞營養需要配制，為玉米-豆粕型飼糧，其組成及營養水平見表1。試驗開始前對雞舍進行消毒。采用3層重疊式籠養，自由采食與飲水。采用自然采光和白熾燈補光相結合，24 h光照。注意保溫，記錄每天的喂料量、溫度和濕度。按正常免疫程序進行免疫接種。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能

分別于試驗的第1、21和42天空腹稱量各重復試驗雞的體重，并記錄其耗料量，計算各階段平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 血清免疫球蛋白含量

試驗第42天，每個重復隨機挑選1只健康并且接近平均體重的雄性肉仔雞，頸靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min(新康X703 80-2醫用離心機)，取上清液，分裝于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱(Thermo Fisher 88500V63，美國)保存待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購自上海酶聯生物科技有限公司)測定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量。

1.3.3 腸道形態學觀察

試驗第42天，每個重復隨機挑選1只健康并且接近平均體重的雄性肉仔雞，屠宰后剪取3～5 cm的十二指腸、空腸和回腸腸段，腸段內容物用0.9%生理鹽水緩慢沖洗干凈，放入4%甲醛溶液中固定24 h以上，進行常規石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色法進行染色，在倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS CKX53，日本)下觀察，測量腸道的絨毛高度、隱窩深度，并計算腸絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)。

1.3.4 盲腸微生物區系

取上述屠宰肉仔雞的盲腸內容物于2 mL滅菌EP管中，置于-80 ℃冰箱(Thermo Fisher 88500V63冰箱，美國)保存。由北京百邁客生物科技有限公司基于Illumina HiSeq 2500平臺，采用雙末端測序(paired-end)方法進行細菌16S rDNA高通量測序分析，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增，再純化擴增產物，構建文庫，上機測序以及結果分析等。

1.4 數據統計分析

試驗數據使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，以P<0.05為差異顯著的標準。

2 結 果

2.1 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對肉仔雞生長性能的影響

由表2可知，1～21日齡，與NC組和AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞21日齡體重、ADG和ADFI無顯著差異(P>0.05)；與NC組相比，AP+FOS組F/G顯著降低(P<0.05)；與AC+FOS組相比，AP+FOS組和AP+AC+FOS組肉雞21日齡體重和ADG顯著提高(P<0.05)，AP+FOS組F/G顯著降低(P<0.05)。22～42日齡，與NC組相比，AN組、AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞42日齡體重和ADG均顯著提高(P<0.05)，且F/G均顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞42日齡體重、ADG和F/G均無顯著差異(P>0.05)；各組肉仔雞ADFI無顯著差異(P>0.05)，但AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞ADG顯著高于AP+AC+FOS組(P<0.05)。1～42日齡，與NC組相比，AN組、AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞ADG均顯著提高(P<0.05)，F/G均顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞ADG無顯著差異(P>0.05)；各組肉仔雞ADFI無顯著差異(P>0.05)。

表2 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對肉仔雞生長性能的影響

2.2 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞血清免疫指標的影響

由表3可知，與NC組和AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組和AP+AC+FOS組肉仔雞血清IgA含量顯著提高(P<0.05)，且AP+FOS組、AP+AC組和AP+AC+FOS組肉仔雞血清IgA含量顯著高于AC+FOS組(P<0.05)。與NC組和AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞血清IgG含量顯著提高(P<0.05)，且AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞血清IgG含量顯著高于AP+AC+FOS組(P<0.05)。與NC組相比，AN組、AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞血清IgM含量顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞血清IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞血清免疫指標的影響

2.3 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞腸道形態的影響

由表4可知，與NC組相比，AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)。與NC組相比，AN組、AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞十二指腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞十二指腸隱窩深度差異不顯著(P>0.05)。與NC組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞十二指腸V/C顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞十二指腸V/C顯著提高(P<0.05)。

表4 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞腸道形態的影響

2.4 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物區系的影響

2.4.1 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物alpha多樣性的影響

由表5可知，與NC組相比，AP+FOS組肉仔雞盲腸微生物ACE指數顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞盲腸微生物ACE指數顯著提高(P<0.05)。與NC組相比，AP+FOS組肉仔雞盲腸微生物Chao1指數顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組和AP+AC+FOS組肉仔雞盲腸微生物Chao1指數顯著提高(P<0.05)。與NC組相比，AN組、AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組肉仔雞盲腸微生物Shannon指數差異不顯著(P>0.05)，AP+AC+FOS組顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組肉仔雞盲腸微生物Shannon指數顯著提高(P<0.05)，AP+AC+FOS組顯著降低(P<0.05)，AP+AC組和AC+FOS組差異不顯著(P>0.05)。

表5 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物alpha多樣性的影響

2.4.2 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物門水平物種組成的影響

圖1展示了42日齡肉仔雞盲腸微生物門水平的相對豐度排行前10位的微生物。從圖中可以看出，各組盲腸菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和軟壁菌門(Tenericutes)等組成，優勢菌門為厚壁菌門和擬桿菌門。從圖2可以看出，與NC組相比，AN組厚壁菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)，AP+FOS組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組厚壁菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組厚壁菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)。與NC組相比，AN組擬桿菌門相對豐度顯著降低(P>0.05)，AP+FOS組和AC+FOS組顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組擬桿菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)。此外，除AP+AC+FOS組優勢菌門相對豐度占總菌門豐度的68%外，其余各組優勢菌門相對豐度均占總菌門豐度的80%以上，且AN組優勢菌門相對豐度最高，達到了89%。

Firmicute:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Verrucomicrobia: 疣微菌門;Proteobacteria:變形菌門;Actinobacteria:放線菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Synergistetes:互養菌門;Cyanobacteria:藍藻細菌門;Elusimicrobia:迷蹤菌門;Deferribacteres:脫鐵桿菌門;Others:其他。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

bacteria at phylum level

2.4.3 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物屬水平物種組成的影響

圖3展示了42日齡肉仔雞盲腸微生物屬水平的相對豐度排名前30位的微生物。從圖中可以看出，各組的前30位微生物總和占總菌屬豐度80%以上。從圖4可以看出，與NC組相比，AN組未培養細菌f毛螺菌科(uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae)相對豐度顯著提高(P<0.05)，AP+AC+FOS組顯著降低(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組未培養細菌f毛螺菌科相對豐度顯著降低(P<0.05)。與NC組和AN組相比，AP+AC組瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)相對豐度顯著提高(P<0.05)。與NC組相比，AP+FOS組、AP+AC組和AC+FOS組互養菌屬(Synergistes)相對豐度顯著提高(P<0.05)；與AN組相比，AP+FOS組、AP+AC組、AC+FOS組和AP+AC+FOS組互養菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)。與NC組和AN組相比，AP+FOS組和AC+FOS組脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)相對豐度顯著提高(P<0.05)。

[Ruminococcus]_torques_group:瘤胃球菌轉矩群;Bacteroides:擬桿菌屬;Uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae:未培養細菌f毛螺菌科;Akkermansia:艾克曼菌屬;Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科UCG-014;Uncultured_bacterium f_Ruminococcaceae:未培養細菌f瘤胃球菌科;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Olsenella:歐陸森氏菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Subdoligranulum:小球菌屬;Ruminococcaceae_NK4A214_group:瘤胃球菌科NK4A214群;Uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae:未培養細菌f鼠桿菌科;Lactobacillus:乳桿菌屬;Alistipes:別樣桿菌屬;Butyricicoccus:丁酸球菌屬;Ruminiclostridium_5:瘤胃梭菌屬5;Megamonas:巨單胞菌屬;Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬;Uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39:未培養細菌o柔膜菌綱RF39;Slackia:斯萊克氏菌屬;Ruminiclostridium_9:瘤胃梭菌屬9;[Eubacterium]_coprostanoligenes_group:產糞甾醇真細菌群;Synergistes:互養菌屬;Others:其他。

圖4 屬水平差異菌相對豐度

3 討 論

3.1 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對肉仔雞生長性能的影響

生長性能是反映肉仔雞生長最直接的指標，提高生長性能是增加經濟效益的關鍵[8]。研究發現，飼糧單獨添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖均能夠提高家禽的生長性能[9-11]。黃劍韜等[12]報道，在“麒麟雞”飼糧中組合添加酸化劑與寡糖，在1～14日齡和1～28日齡對提高ADG互作效應顯著。余紹海[13]研究發現，甘露寡糖與抗菌肽組合使用對肉用番鴨的日增重增加效果顯著高于抗生素、甘露寡糖和抗菌肽單獨使用，同時顯著降低F/G。本試驗研究結果表明，飼糧聯合添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖顯著提高肉仔雞42日齡體重和1～42日齡ADG，并顯著降低22～42日齡和1～42日齡F/G，對提高肉仔雞的生長性能有積極的影響。這一試驗結果證明了飼糧聯合添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖對肉仔雞的促生長作用。這可能與抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖參與養分代謝有關。抗菌肽含有小分子多肽及未知生長因子等多種生物活性物質，可提高腸道消化吸收[14]，而酸化劑可通過降低腸道pH，促進腸道消化[15]，功能性寡糖能夠通過提高腸道消化酶活性，提高飼料的消化率[16]。最終，這些有益作用都將反映到生長性能。抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖都具有提高腸道消化吸收的能力，組合添加存在一定的協同作用，從而提高了肉仔雞的生長性能。

3.2 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞血清免疫指標的影響

禽類有3種免疫球蛋白，即IgA、IgG和IgM[17]。這3種免疫球蛋白是介導體液免疫的主要抗體，也是衡量免疫功能的重要指標，其水平越高則免疫功能越強[18]。吳東等[19]研究發現，抗菌肽可以顯著提高肉仔雞血清IgA和IgG含量。田麗娜等[20]報道，飼糧添加抗菌肽Sublancin可以顯著提高蛋雞血清IgA、IgG和IgM含量，增強機體免疫力。本試驗研究結果顯示，飼糧聯合添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖可以提高肉仔雞血清免疫球蛋白含量。其中抗菌肽分別與酸化劑和功能性寡糖組合使用的血清IgA含量顯著高于酸化劑與功能性寡糖組合，血清IgG含量顯著高于三者合用的組合，達到了添加抗生素的效果，在血清免疫指標方面效果較好，能夠有效提高肉仔雞的免疫性能。分析原因可能是抗菌肽中所含的生物活性物質可以有效調節機體的免疫系統[14]，促進免疫球蛋白的合成[21]；也可能是抗菌肽分別與酸化劑和功能性寡糖的協同作用導致，目前聯合使用的研究較少，具體機制需要開展進一步深入研究。

3.3 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞腸道形態的影響

腸道形態學已經成為評估腸道營養效果的常用研究工具[22]。腸道的形態變化可以揭示腸道的健康狀況[23]，同時它的絨毛高度、隱窩深度及其二者比值是反映腸道結構完整性的重要指標[24]。王建[25]在肉仔雞飼糧中添加抗菌肽Api-PR19，結果顯著改善了21日齡空腸和42日齡十二指腸的絨毛高度和V/C。白潔[26]研究發現，肉仔雞飼糧添加100 mg/kg殼寡糖能夠顯著提高空腸絨毛高度和V/C，并且顯著降低隱窩深度。Giannenas等[27]在肉仔雞飼糧中添加0.3%苯甲酸，結果能顯著提高肉仔雞空腸絨毛高度。本試驗研究結果表明，飼糧聯合添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖可以顯著降低十二指腸和回腸隱窩深度，并顯著提高十二指腸和回腸V/C。這一試驗結果證明了聯合添加抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖對肉仔雞腸道形態的改善作用。Xiao等[28]報道，抗菌肽通過抑菌或殺菌作用，減少有害菌對腸黏膜的破壞，從而改善腸道黏膜形態。黃靈杰等[29]研究發現，飼糧添加苯甲酸可以降低腸道pH，增加機體細胞分裂，提高絨毛高度，改善腸道形態。黃永潔[30]研究表明，功能性寡糖也能防止腸黏膜上皮細胞萎縮，有利于保持腸黏膜上皮的完整性，改善腸道結構。以上研究結果說明，抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖都具有促進腸道發育的能力，聯系到本試驗生長性能，進而提高其消化吸收能力，聯合添加在一定程度上改善了肉仔雞的腸道形態發育，促進了肉仔雞的健康生長。

3.4 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加對42日齡肉仔雞盲腸微生物區系的影響

腸道微生態系統是影響動物消化吸收能力的重要因素，腸道菌群平衡有助于提高動物的消化吸收能力[31]，有利于保持動物機體的健康[32]。在alpha多樣性分析中發現，抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加在飼糧中都能夠對盲腸微生物的多樣性有一定的改善作用，且抗菌肽與功能性寡糖組合添加的Shannon指數顯著高于三者合用，有較高的群落多樣性。雞的盲腸微生物在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門構成了大多數微生物群落，它們在能量的產生和代謝中起著重要作用[33-35]，這與本研究結果相一致。本試驗研究結果表明，厚壁菌門和擬桿菌門是肉仔雞腸道內相對豐度比例較高的菌群。在屬水平上，有研究發現，瘤胃球菌科UCG-014具有抗炎性的功能，能起到降低和改善腸道炎癥的作用[36]；互養菌屬在反芻動物腸道中可以抑制飼糧中毒素的作用，穩定腸道內環境[37]；據報道，脫硫弧菌屬與腸炎、腸癌以及某些代謝疾病發生有關[38]，毛螺菌科與人類疾病有關，如腹腔疾病和潰瘍性結腸炎[39]。本試驗研究結果發現，抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖兩兩組合與NC組相比增加了肉仔雞盲腸中瘤胃球菌科UCG-014、脫硫弧菌屬和互養菌屬的相對豐度，降低了未培養細菌f毛螺菌科的相對豐度。抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖都具有限制病原菌增殖和穩定腸道菌群的優點[21,40-41]，聯合添加在改善動物腸道微生物平衡方面具有協同作用，改善了肉仔雞盲腸微生物多樣性和菌群豐度，促進了腸道健康。

4 結 論

① 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加可以提高肉仔雞后期和全期生長性能，同時也提高了血清免疫球蛋白含量，增強了機體的免疫。其中抗菌肽分別與酸化劑和功能性寡糖組合添加增強機體免疫性能方面效果較好，優于抗生素組，具有替代抗生素的潛質。

② 抗菌肽、酸化劑和功能性寡糖聯合添加可以改善肉仔雞小腸腸道形態，提高盲腸微生物多樣性，調節肉仔雞盲腸微生物的菌群豐度，促進腸道健康。