飼糧添加香菇多糖對輪狀病毒攻毒斷奶仔豬回腸屏障功能的影響

毛湘冰 胡海燕 陳代文 余 冰 何 軍 鄭 萍 虞 潔 羅鈞秋 羅玉衡 閻 輝

(四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養教育部重點實驗室，農業農村部動物抗病營養與飼料重點實驗室，動物抗病營養四川省重點實驗室，成都 611130)

香菇(shiitake mushroom)是食用最廣泛的蘑菇之一，其口感好且營養價值高，多產于亞洲(如中國、日本)。香菇多糖(lentinan,LNT)是從香菇子實體中浸提得到的一種含支鏈分子的多糖，它的主要成分是β-(1→3)-D-葡聚糖，是具有生物活性的大分子物質。近些年，相關的臨床和亞臨床研究表明，LNT能調節免疫功能和抗氧化能力，進而發揮抗腫瘤和抗病毒的作用[1-5]。本團隊前期的研究表明，飼糧添加LNT能改善斷奶大鼠生長性能、抗氧化能力、盲腸微生物組成和空腸黏膜結構[6]，并能改善斷奶仔豬的生長性能和免疫力[7]。

作為一種雙鏈RNA病毒，輪狀病毒(rotavirus,RV)是導致幼齡動物和嬰幼兒嚴重胃腸炎和腹瀉的主要病原之一；流行病學分析發現，仔豬對RV極為易感，初生仔豬感染其的死亡率可達100%，盡管斷奶后死亡率會下降，但仍顯著影響仔豬生長性能；此外，RV易感部位為消化道前段(如十二指腸、空腸)[8-10]；也有研究報道，RV也會侵襲回腸，并損傷回腸健康[11]。本團隊前期的研究已表明，飼糧添加LNT可以改善RV攻毒對仔豬空腸屏障功能的負面影響[12]。但目前對于飼糧添加LNT是否也能夠緩解RV攻毒對仔豬回腸健康產生的負面影響尚未見報道。因此，本試驗旨在探索飼糧中添加LNT是否能緩解RV攻毒仔豬回腸屏障功能的負面影響，以期進一步完善LNT預防RV感染的可能機制，為LNT在動物生產上的應用和推廣提供理論和試驗支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LNT購于四川某生物科技有限公司，其有效成分(多糖)含量>30%；RV為OSU(G5P9)毒株(ATCC#VR-893)，購自國家獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗動物與設計

試驗選取28頭體重為(7.51±1.37)kg、健康的21日齡斷奶的雜交(“杜×長×大”)閹公豬，采用2×2因子試驗設計，即飼糧處理(飼糧添加0或84 mg/kg LNT)和RV攻毒(灌服RV或無菌培養液)。全部仔豬采用代謝籠(1.5 m×0.7 m×1.0 m)飼養。試驗第1天，將所有仔豬進行空腹稱重，按遺傳背景和體重相近原則，將仔豬隨機分為2個處理(n=14)，分別飼喂添加不同劑量LNT的飼糧。試驗第15天，所有仔豬在灌服5 mL的100 mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液20 min后，從以上2個飼糧處理中隨機選取7頭仔豬進行RV攻毒，即經口一次性灌服RV液(106TCID50/mL)4 mL，剩余仔豬經口一次性灌服無菌培養液4 mL。試驗期為19 d。

1.3 試驗飼糧及營養水平

試驗使用的基礎飼糧為玉米-豆粕型，依據NRC(2012)7～11 kg仔豬營養需要進行設計和配制，其組成及營養水平見表1。而試驗飼糧是在基礎飼糧中添加0或84 mg/kg LNT進行配制，且LNT是以等量替代基礎飼糧中的玉米淀粉進行加入。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.4 飼養管理

所有的動物試驗于四川農業大學動物營養研究所教學科研基地代謝室進行。試驗的預試期為2 d，使所有仔豬適應粉狀飼糧和飼養環境。試驗期內，豬舍的溫度為27～30 ℃，相對濕度低于80%；每日飼喂仔豬4次(08:00、12:00、16:00和20:00)，以每次采食后料槽略有余料為度，自由飲水。試驗期間消毒、清掃按常規程序進行，保持豬舍通風、清潔。

1.5 RV培養

本試驗采用恒河猴腎細胞系(MA104)進行RV培養、強化和病毒滴度測定，具體方法按Mao等[13]進行。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 腹瀉指數

RV攻毒后，對每頭仔豬進行糞便評分(0，正常；1，黏性糞便；2，半液體狀糞便；3，液體狀糞便)，每天2次。用于計算仔豬的腹瀉指數，具體方法參考Mao等[13]。

腹瀉指數=(∑糞便評分)/n。

式中:n為重復數。

1.6.2 樣品采集

試驗第20天，對所有仔豬進行空腹采血10 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血清，保存于-20 ℃。采血后，以心臟注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)和頸靜脈放血的方法屠宰所有仔豬，迅速分離回腸，冰生理鹽水沖洗，用載玻片刮取回腸黏膜，液氮速凍，保存于-80 ℃；同時，收集回腸食糜，液氮速凍，保存于-80 ℃。

1.6.3 回腸黏膜中RV特異性抗體(rotavirus antibody,RV-Ab)、分泌型免疫球蛋白A(secreting immunoglobulin A,sIgA)和細胞因子含量的檢測

稱取約1 g回腸黏膜組織，按1∶9(質量體積比)加入預冷的生理鹽水，在冰上勻漿，勻漿液于4 ℃條件下5 000×g離心10 min，取上清液用于RV-Ab(免疫球蛋白M)、sIgA、白細胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、白細胞介素-4(interleukin 4,IL-4)和干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)含量的測定，具體測定采用上海諾淵有限公司生產的酶聯免疫吸附試劑盒完成，操作按照試劑盒說明書進行；上清液中蛋白含量的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，具體的測定方法參照試劑盒說明書。

1.6.4 血清和回腸黏膜抗氧化能力的測定

稱取約1 g回腸黏膜組織，按1∶9(質量體積比)加入預冷的生理鹽水，在冰上勻漿，勻漿液于4 ℃條件下5 000×g離心10 min，取上清液用于檢測。

血清和回腸黏膜組織上清液樣品中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，具體的測定方法參照試劑盒說明書。

1.6.5 回腸黏膜中細胞凋亡、黏液蛋白、緊密連接蛋白和抗菌肽基因mRNA相對表達量的測定

回腸黏膜中B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia 2-associated X protein,Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia 2,Bcl-2)、閉合蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens 1,ZO-1)、黏液蛋白1(mucin 1)、黏液蛋白2(mucin 2)、豬β防御素1(porcine β-defensin 1,pBD1)、豬β防御素2(porcine β-defensin 2,pBD2)、豬β防御素3(porcine β-defensin 3,pBD3)和Protegrins 1-5(PG1-5)的mRNA相對表達量，采用實時熒光定量PCR技術測定，具體方法參考Mao等[13]。

1.6.6 回腸食糜中菌群數量的測定

回腸食糜中菌群(總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌)的數量采用實時熒光定量PCR技術測定，具體方法參考Mao等[12]。

1.7 數據處理與分析

試驗測得的所有數據采用Excel 2016進行初步整理。除了腹瀉指數的數據外，其他數據采用SAS 8.1軟件中雙因素方差分析，模型主效應包括RV攻毒和飼糧添加LNT以及二者之間的互作效應，差異顯著時進行Duncan氏法多重比較，各指標以每個重復為單位統計，數據以“平均值±標準誤”表示。以P<0.05為差異顯著判定標準，以0.05≤P<0.10為有差異趨勢的判定標準。

2 結 果

2.1 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬腹瀉指數和回腸黏膜中RV-Ab含量的影響

由圖1可知，未攻毒仔豬腹瀉指數均為0，RV攻毒提高了斷奶仔豬的腹瀉指數，飼糧添加LNT降低了RV攻毒誘導的腹瀉指數。由表2可知，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中RV-Ab的含量(P<0.05)。

圖1 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬腹瀉情況的影響

2.2 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和細胞因子含量的影響

由表2可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA、IL-4和IFN-γ的含量(P<0.05)，顯著提高了回腸黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和IFN-γ的含量(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對回腸黏膜中sIgA、IFN-γ和IL-2含量的影響(P<0.05)。

表2 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA、RV-Ab和細胞因子含量的影響

2.3 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬血清和回腸黏膜抗氧化能力的影響

由表3可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬血清和回腸黏膜的T-AOC(P<0.05)，顯著提高了血清和回腸黏膜中MDA的含量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬血清和回腸黏膜的T-AOC(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中MDA的含量(P<0.05)，有降低血清中MDA含量的趨勢(P=0.06)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對血清和回腸黏膜T-AOC及回腸黏膜中MDA含量的影響(P<0.05)。

表3 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬血清和回腸黏膜抗氧化能力的影響

2.4 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中細胞凋亡、黏液蛋白、緊密連接蛋白和抗菌肽基因mRNA相對表達量的影響

由表4可知，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中Bax的mRNA相對表達量(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對表達量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對表達量(P<0.05)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對回腸黏膜中occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對表達量的影響(P<0.05)。

表4 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中細胞凋亡、緊密連接蛋白、黏液蛋白和抗菌肽基因表達的影響

2.5 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸食糜中菌群數量的影響

由表5可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸食糜中雙歧桿菌、乳酸菌和總菌的數量(P<0.05)；但飼糧添加LNT對斷奶仔豬回腸食糜中菌群數量無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧添加LNT對RV攻毒斷奶仔豬回腸食糜中菌群數量的影響

3 討 論

在誘導幼齡動物和嬰幼兒胃腸炎和腹瀉的病原中，RV是主要的病毒性病原之一[8-10]。在目前的仔豬試驗中，RV攻毒提高了斷奶仔豬的腹瀉指數，影響了回腸的炎性細胞因子水平和食糜中有益菌群數量，損傷了回腸的抗氧化能力和黏膜屏障功能，這與本課題組前期的研究結果[14-16]一致。除此之外，本試驗結果表明，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中RV-Ab的含量；且對于生長性能的觀察發現，RV攻毒還顯著降低了斷奶仔豬的生長性能[17]。由此可知，本研究成功構建了斷奶仔豬RV感染模型；而飼糧添加LNT可降低斷奶仔豬腹瀉指數，并在一定程度縮短腹瀉病程，以及改善了RV攻毒斷奶仔豬的生長性能[17]，這說明其可改善仔豬機體(尤其是腸道黏膜)的健康。

腸道的免疫功能是機體抵御病原入侵的重要屏障之一。免疫球蛋白(尤其是sIgA)在保護腸道黏膜免受病原侵襲和抑制病毒增殖等方面發揮著十分重要的作用[18]。除此之外，細胞因子也是腸道免疫功能的重要組成成分。Th1/Th2細胞因子的平衡可以有效地維持免疫功能[19]；且IFN-γ是一種廣譜的抗病毒成分，能通過誘導細胞產生抗病毒蛋白抑制病毒增殖[20]。內源性抗菌肽的產生是先天性免疫的組成成分，而防御素是一類由白細胞和上皮細胞產生的內源性抗菌肽，其在抗病毒入侵中也發揮了重要的作用[21]。本試驗的結果表明，在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT提高了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和IFN-γ含量，上調了回腸黏膜中pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA表達，緩解了RV攻毒對回腸黏膜中IL-2和IL-4含量的影響。這些表明，飼糧添加LNT改善了仔豬回腸黏膜免疫功能，進而緩解了RV感染。

物理屏障和化學屏障也是腸道屏障功能的重要組成成分，物理屏障主要體現在腸道黏膜上皮細胞間的緊密連接，而腸道黏膜膠質層是化學屏障的主要來源[22]。一般來說，腸道上皮細胞間緊密連接的狀態可由相關緊密連接蛋白表達量說明[23]；腸道黏膜膠質層的主要成分是由黏膜上皮細胞(尤其是杯狀細胞)產生的黏液蛋白[24]。本試驗的結果表明，飼糧添加LNT可緩解RV攻毒對仔豬回腸黏膜中上皮緊密連接蛋白(ZO-1和occludin)和黏液蛋白(mucin 1和mucin 2)基因表達的影響，那么，LNT防止RV侵襲回腸可能與其增強腸道黏膜物理屏障和化學屏障有關。

機體的氧化還原平衡與細胞(乃至生物體本身)的健康息息相關，細胞、組織和器官內的氧化應激將誘導凋亡的發生，進而破壞組織和器官的相關功能[25]。起始于細胞線粒體內的凋亡受到Bcl-2家族蛋白的調節，其中，就包含抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax)[26-27]。而本實驗室前期的試驗表明，RV感染引起的腸道屏障功能(尤其是物理屏障和化學屏障)損傷主要源于其通過破壞腸道上皮細胞的氧化還原狀態導致了細胞凋亡的增加[28]。本試驗的結果表明，在RV感染仔豬中，飼糧添加LNT提高了仔豬血清T-AOC，從而提高了仔豬回腸黏膜的抗氧化能力，改善了RV誘導的氧化還原狀態失衡；并提高了仔豬回腸黏膜中Bcl-2的mRNA相對表達量。因此，LNT改善RV攻毒仔豬回腸屏障功能(尤其是物理屏障和化學屏障)與其緩解氧化還原狀態失衡誘導的細胞凋亡有關。

本實驗室前期以大鼠和斷奶仔豬為對象的研究表明，飼糧添加LNT可調節盲腸內容物菌群組成(即提高有益菌的數量，降低有害菌的數量)[6,12]。但本試驗的結果表明，飼糧添加LNT對回腸食糜中總菌、大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌的數量均未產生顯著影響。這可能說明，LNT對這些測定的腸道菌群調節作用主要集中于后腸段(即大腸)，而LNT對整個腸段中微生物菌群的影響還有待于通過高通量測序的方式進行深入研究。

基于本試驗中LNT可改善回腸屏障功能，緩解RV侵入回腸，與本實驗室前期進行的LNT處理調節RV感染仔豬空腸屏障功能的研究結果[7,12]對比，可以發現LNT在回腸中的改善效果并未達到其在空腸中的效果。分析其原因，可能在于RV感染對回腸屏障功能的負面影響弱于其對空腸的影響(即RV侵襲部位主要在腸道的前段)。

4 結 論

飼糧添加LNT可以緩解RV感染誘導的斷奶仔豬腹瀉，這一作用可能源于其改善了回腸黏膜上皮細胞抗氧化能力，減弱了RV誘導的細胞凋亡，進而強化了回腸屏障功能(包括免疫功能、物理屏障和化學屏障)。