基于指紋圖譜技術的飼料營養活性物質結構-譜-量-效關系的研究進展

熊安然 熊本海 蔣林樹*

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

飼料中蛋白質、脂肪、碳水化合物等基本營養素因其結構清晰、功能明確，已經全面應用于畜禽的飼糧配方，有力地促進了我國畜牧產業的快速發展[1]。但隨著畜禽養殖環保壓力日益增大和人民對高品質畜產品需求的不斷增加，綠色健康養殖成為我國畜牧業發展的必然趨勢。農業農村部公告第194號規定，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種[2]。飼料營養活性物質所具有的激活動物自身免疫機能、提高體內抗氧化活性和飼料報酬等功能成為后抗生素時代實現畜禽健康養殖的重要技術策略。盧德勛于2004年首次提出了飼料營養活性物質組學理論，隨后進一步提出一套完整的關于健康養殖的營養技術策略的技術體系，認為科學利用飼料營養活性物質是畜禽減抗、健康養殖的重要核心環節[3-5]。陳代文等[6]也在2005年提出了“抗病營養”的理論和技術體系，從動物免疫力的角度證明了科學的營養策略是保障動物健康生產和預防疾病的根本技術手段[7]。因此，具有促進腸道健康、維持免疫和氧化平衡以及調節基因表達等特殊營養調控或保健功能的飼料營養活性物質成為解決畜禽健康養殖的重要技術途徑[7]。

2018年國家將甘草、黃芩等共117種天然植物列入飼料原料目錄[8]。2019年國家發布了《天然植物飼料原料通用要求》[9]，這些藥食同源特性的天然植物被列入飼料原料目錄以及國家相關標準的出臺，為推動飼料中的營養活性物質的研究奠定了重要基礎。但因飼料營養活性成分結構復雜、主效因子不明確，受產地來源、收獲季節、使用部位、加工方式的影響[10]，其分子結構、種類也各有不同[7]，使研究與應用滯后于產業發展的要求[7]。指紋圖譜技術將飼料中的營養活性物質所包含的化學信息通過圖譜的形式進行分析并加以描述，從而獲得飼料中營養活性物質主效成分或有效成分[11-12]，進而結合其代謝途徑、生物學功能等相關研究為飼糧的精準營養和精準配方提供數據支撐[7]。本文系統分析了飼料營養活性物質結構、含量、圖譜、功效等關系，以期為飼料營養活性物質在畜牧生產中的廣泛應用和探索構建基于營養活性物質的飼料質量評價體系提供理論依據及技術支撐。

1 飼料營養活性物質研究的技術基礎

飼料中的營養活性物質可分為類胡蘿卜素、有機酸類、寡糖類、酶類、磷脂、脂肪酸類、多酚和調味劑共8類[1]。指紋圖譜技術可根據物質的不同特性實現對營養活性物質的分離、定性和定量分析[7]。根據特定波長下吸光度不同，利用紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)等光譜技術可以實現對活性成分進行分離；根據處于強磁場中的原子核對射頻輻射的吸收差異，采用核磁共振(NMR)可以獲得有關化合物分子結構信息的分析方法[13]；根據不同的物質在固定相和流動相之間的分配不同，利用高效毛細管電泳(HPCE)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)等色譜技術使待分離物質分子中的不同組分在固定相上相互分離[14]；根據帶電離子在電場和磁場中的質荷比不同，利用質譜(MS)對其分離之后進行檢測，可以獲得化合物的分子質量、化學結構、裂解規律和由單分子分解形成的某些離子間存在的某種相互關系等信息[15]。色譜、光譜及NMR、MS等分析技術的單獨或聯合使用，使抽象的活性物質可以通過指紋圖譜技術可視化，再結合相似度評價、主成分分析、聚類分析和神經網絡等模式識別方法解析、識別飼料或提取物圖譜信息，建立指紋圖譜量化標準，使可視化的圖譜能夠通過計算，從而轉換為數據進行描述，進而對不同飼料原料及不同來源、不同品種、不同批次的飼料中的營養活性物質進行定性和定量分析。

近年來，實驗室利用色譜、光譜等波譜技術以及結合質譜、NMR等聯用技術，先后完成了金銀花、甘草等4類共22種活性成分指紋圖譜的構建及主要活性物質的定性定量分析[16-19]以及相應的動物驗證試驗，研究結果為深入研究飼料營養活性物質結構-譜-量-效關系提供了理論基礎。

2 飼料營養活性物質結構-譜-量-效關系研究現狀

2.1 飼料營養活性物質的譜-構關系

動物飼糧是由各種飼料原料按照一定的配比進行混合、加工所得的混合物，因此具有組成復雜、干擾因素眾多的特點[20]。譜-構關系構建是實現營養活性物質定性定量分析的基礎。將營養活性物質通過HPLC、GC等色譜檢測，得出在一定波長下包含所有化合物的色譜圖。色譜指紋圖譜中的每1個峰都代表了1種物質，對于有標準品的物質可以利用指紋圖譜進行化學成分鑒定，沒有標準品的化學成分則可以用指紋圖譜來表征[21]。根據NMR中氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)等核磁共振圖譜與成分之間對應關系，以及質譜中顯示的不同的m/z的離子，得到所測化合物的精確質量數和經驗分子式，再結合化合物在質譜中的碎片機理和規律以及相關文獻即可鑒定出活性成分的化學結構[21-22]。通過對圖譜和結構的分析建立飼料營養活性物質的譜-構關系。

Guo等[23]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-飛行時間串聯質譜(HPLC-DAD-QTOF-MS/MS)技術，通過將保留時間、紫外、準分子離子、斷裂途徑與參考標準及相關文獻進行比較，鑒定出了厚樸中的31種次木脂素、生物堿和苯丙素苷類化合物的結構。趙瑩等[24]通過對小麥粉和小麥麩皮的風味物質進行圖譜分析，發現生長在作物不同部位的風味物質的成分結構不同。同樣，Chen等[25]利用ESI/MS、13C-NMR和1H-NMR分析得出了無梗五加中的主要花青素結構為Cya-3-Xyl-Gal。譜-構關系研究技術體系的建立為飼料營養活性物質的深入研究提供了方法基礎。

2.2 飼料營養活性物質的譜-量關系

飼料原料受品種、產地、采集時間、提取工藝等影響，不同品種、不同來源、不同批次、不同提取方法得到的飼料中的營養活性物質的含量與品質存在較大差異[10]。張巧娥等[26]研究結果所示，不同提取方法可獲得同樣種類的代謝物，但相對含量存在顯著差異，同一類活性物質在不同提取工藝下，結構、組分也存在顯著差異。因此，飼料營養活性物質的譜-量關系研究包括2個方面的內容，即指紋圖譜對營養活性物質的含量測定、品質鑒定以及指紋圖譜結合指標成分定量的研究。色譜-光譜-質譜等聯用技術可實現飼料中成分含量之間的譜-量關系研究。

通過參照對照圖譜并根據保留時間確定所測成分峰的位置，之后采用內標法、外標法，HPLC的外標一點法、外標兩點法、標準曲線法等含量測定方法建立相關模型，根據所測峰的峰面積計算出所測成分的含量。Chen等[25]通過HPLC-DAD得出每100 g無梗五加果實中總花青素含量為121.35 mg。Fu等[27]利用HPLC-DAD定量和LC-ESI-QTOF-MS/MS定性鑒定了不同地區青蒿中5種黃酮類化合物、2種香豆素類化合物和4種倍半萜類化合物的含量。沒有標準品的化合物，通過指紋圖譜技術結合化學計量學方法(相似度、聚類分析、主成分分析)對建立的指紋圖譜的特征峰峰面積進行統計分析和不同批次、不同產地、不同提取工藝中共有峰含量進行相似度評價，從而實現對飼料的品質鑒定[12]。Fu等[27]利用HPLC-DAD定量和LC-ESI-QTOF-MS/MS結合主成分分析和層次聚類分析發現不同地區或者同一地區不同批次的青蒿中這11種成分的含量具有明顯的區域特征。

2.3 飼料營養活性物質的譜-效關系

飼料中的營養活性物質具有抗氧化、抗炎和免疫調節、腫瘤抑制以及生長調控功能[28]，這些活性物質在動物體或者人體內發揮作用與其結構與含量密不可分，指紋圖譜技術通過對化合物進行結構和含量鑒定，有助于進一步研究營養活性物質的生物學作用。

2.3.1 飼料營養活性物質的譜-構-效關系

飼料營養活性物質的譜-效關系研究是基于化學成分研究和作用效果的結合。飼料營養活性物質的化學結構是其發揮生物學作用的物質基礎。吡喃(pyran)是一個不飽和的含氧六元雜環化合物，根據2個不飽和雙鍵位置不同，可以分為2-H吡喃和4-H吡喃，其中4-H吡喃被研究發現具有抗菌、抗過敏、抗腫瘤等諸多藥理活性[29]。因此很多含有吡喃環結構單元的天然產物如色烯(苯并吡喃)、黃酮與異黃酮、花青素等也具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血等生物功能[29]。大豆異黃酮結構與雌二醇相似，都具有二羥苯酚，因而具有類雌激素作用[30-31]。Zhang等[32]采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術，結合1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)方法，得到的光譜結果顯示枸杞中主要抗氧化成分為綠原酸、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。為研究飼料添加劑藤茶不同極性部位HPLC指紋圖譜共有峰與其抗炎藥效之間的譜-效關系，劉雯等[33]運用灰色關聯度法研究發現藤茶對二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用是多組分協同作用的結果，其中HPLC指紋圖譜中的3號峰的未知成分和二氫楊梅素是藤茶抗炎作用的主要活性成分。俎龍輝等[34]通過自制黃芩提取物，建立HPLC指紋圖譜檢測方法，初步確定黃芩提取物抑菌藥效物質基礎主要為漢黃芩苷、漢黃芩素以及白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷。因此，通過指紋圖譜技術對飼料中營養活性物質的成分結構進行鑒定，在一定程度上解釋了物質的作用機理。

2.3.2 飼料營養活性物質的譜-量-效關系

即使具有相同營養活性物質成分的同一種飼料原料或者同一配方，也會因其來源不同、批次不同或提取工藝不同而表現出一定的作用效果差異[26]。飼料營養活性物質的含量與功效需要依據活性物質發揮生物學作用效果來評價[21]。在營養活性物質作用于動物機體之后，一些生物指紋圖譜，如代謝指紋圖譜等可以用來表征飼料中營養活性物質的生物效應[21]。通過多組學聯合分析結合模式識別方法，可以判斷出不同水平的營養活性成分對生物體的生理狀態及健康水平的影響，并有可能找出與之相關的生物標志物，進而解析這些成分在動物體內的作用途徑和作用機制[35]。Ibrahim等[36]利用高效薄層色譜(HPTLC)得到苜蓿發芽之后的色譜指紋圖譜，使用主成分分析進行無監督模式識別方法得出木犀草素-7-O-葡萄糖苷、阿魏酸和對香豆酸是代謝上重要的標志物，通過對這3個關鍵標志物進行定量分析發現，苜蓿種子和不同日齡苜蓿芽提取物在植物化學、營養和功效特性上發生了顯著的變化。HMDB[37]、KEGG[38]、Metlin[39]、GMD[40]和SMPDB[41]等代謝物數據庫整合了代謝產物的簡介、化學式、分子質量、化學分類、化學性質、所在的代謝通路和質譜圖等[42]。用戶可以將待鑒定物質的信息與庫中代謝物的信息進行一一比對，從而了解到所需代謝物的生物學作用、生理濃度、疾病關聯、化學反應、代謝途徑和參考光譜的全面信息[37]。指紋圖譜作為一種分析工具，在代謝組學的研究及營養活性物質數據庫的構建當中發揮了重要作用。

在研究飼料中的營養活性物質組的生理功能時，要注意區分發揮作用效果的主效因子和有效因子，既要強調所有主效因子的整體功能，又要區分飼料營養活性物質主效因子的主次順序[1]。而營養活性物質譜-量-效關系的確定，一方面將有助于找到添加劑當中發揮作用效果的主效成分，Tang等[43]通過高效凝膠滲透色譜(HPGPC)發現枸杞多糖中發揮抗血糖作用的主要是水溶性多糖3b(LBP3b)，結合體外細胞試驗，結果顯示LBP3b在不同濃度下均能顯著抑制葡萄糖的吸收，且LBP3b濃度越高，葡萄糖攝取越少，抑制葡萄糖攝取的效果越好。Hussain等[44]通過研究雙低菜籽粕中酚提取物的抗氧化活性發現HPLC色譜峰中峰2(阿魏酰膽堿桂酰基)是丙酮提取物中相對含量第6大的成分，但是卻是在線ABTS自由基清除跡線中的第2個最高峰，反映了較強的自由基清除活性，是雙低菜籽粕中酚提取物發揮抗氧化作用的主效因子，說明物質的活性與其相對濃度不成比例。通過體內外相關試驗與指紋圖譜結合，可以揭示營養活性物質發揮生物學作用的主效因子，從而可以開展整體功能檢驗與評價。另一方面，可以確定飼料營養活性物質最佳作用效果的最適含量，從而保證其作用效果，避免出現在相同的添加劑量上，不同來源的同種原料表現出不同的促進健康的作用的情況。Lopes等[45]通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧電離/質譜(HPLC-DAD-ESI/MSn)對薰衣草的酚類成分進行表征，并通過體外分析其抗氧化潛力(DPPH自由基清除活性，降低脂質過氧化能力并抑制脂質過氧化)，對其生物活性進行了評價，結果發現，來自不同地區的薰衣草的生物活性存在差異，與后山(Trás-os-Montes)地區樣品相比，來自阿連特茹的樣品在所有生物活性方面均顯示出更高的結果。綜上所述，飼料營養活性物質譜-量-效關系對確定飼料成分及飼料品質、優化飼料配方具有很大的參考價值。

3 結構-譜-量-效綜合評價為導向的飼料質量評定方法探索

目前關于飼料營養活性物質的研究與應用還處于探索階段，今后需要從以下幾個方面深入開展相關的研究：1)常用飼料營養活性物質有效因子和主效因子測定、特征指紋圖譜數據庫建立及定量構效關系模型構建。探究飼料營養活性物質對機體生理功能和代謝的影響，找到發揮主要作用的主效因子以及發揮作用的主次順序，建立常用飼料以及飼用天然植物飼料原料的特征指紋圖譜和主效因子數據庫，以數據庫構建為基礎，采用計算機靶標預測技術，構建營養活性物質與機體免疫互作網絡模型，實現對飼料營養活性物質的科學應用[1]；2)飼料或飼糧營養活性物質功效關系評價技術及其作用機理的研究。通過細胞培養和離體試驗等體外培養方法，建立主效功能因子體外快速評價技術體系；利用動物試驗結合營養生理方法，揭示與評價飼糧營養活性物質主效因子的整體功效[1]。通過細胞試驗和動物試驗，結合譜效關系，揭示主效因子對動物生產性能及免疫相關基因表達調控的分子機制；3)飼糧營養活性物質營養標準和評價指標的研究；將不同產地、不同來源、不同批次的同種飼料原料進行特征指紋圖譜構建與比對，結合相似度評價系統對其營養活性物質的進行定量分析和量效關系評價；4)營養活性物質產品研發和應用技術[1]。研究優化飼料中主要營養活性物質的提取方法，制定相應的提取標準或規范，結合譜-量-效關系，為營養活性物質產品研發和應用提供技術支撐。

4 小 結

通過指紋圖譜等現代分析技術，結合飼養或代謝試驗，揭示飼料中營養活性物質成分、生物學作用、作用機制以及物質結構、含量和作用效果關系，構建結構-譜-量-效綜合評價為導向的飼料質量評價方法，實現成分、結構、含量、品質和生物學作用的直觀反映，是飼料營養活性物質在實際生產中廣泛應用的技術基礎。隨著營養活性物質研究的不斷深入，將營養活性物質的種類、結構、量效關系進行分類整理，構建飼料中營養活性物質的特征指紋圖譜數據庫，實現飼料營養活性物質成分及量效作用的快速定性定量分析和畜禽飼糧的精準配合，將有效提高動物的健康狀況，實現畜牧業的綠色健康發展。