硒對奶牛乳腺氧化應激及炎癥反應的調控作用及其機制

郭詠梅 閆素梅

(內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

隨著奶牛產奶性能的不斷提高，乳腺代謝率相應增加，尤其在圍產期和泌乳高峰期，旺盛的代謝導致短時間內產生大量的自由基超過了機體的清除防御能力，進而誘發氧化應激及失調性炎癥反應，這對于高產奶牛尤為嚴重。乳腺細胞的氧化損傷和降低的抗氧化機能不僅影響了動物的福利，而且甚至降低了乳產量和乳品質，給奶牛養殖業造成巨大的經濟損失[1]。體內與體外的大量研究表明，硒可以有效減緩奶牛氧化應激及炎癥反應，從而改善健康狀況，降低發病率，促進乳蛋白的合成[2-4]。研究發現，硒的抗氧化功能是通過調節硒蛋白來實現的，主要包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)及硫氧還蛋白還原酶(TrxR)家族；硒蛋白可以通過調節細胞內信號通路從而調節機體氧化與抗氧化之間的穩態平衡[5]。因此，本文從硒蛋白及其對相關信號通路的調控角度總結硒緩解奶牛氧化應激、調節免疫應答的機制，有助于構建更加合理的營養策略，減緩代謝性疾病，改善奶牛健康。

1 氧化應激及炎癥反應的產生

氧化應激水平增加是誘導奶牛乳腺炎癥反應和免疫功能障礙的主要因素。研究發現，處于圍產期或泌乳前期的奶牛乳腺氧化應激水平升高，促炎細胞因子的基因表達顯著提高[16]；而中性粒細胞L-選擇蛋白的基因表達顯著降低[17]。大量的ROS可誘導奶牛肺泡細胞產生氧化應激，并通過信號轉導進一步促進炎癥生物標志物環氧合酶-2(COX-2)的表達[18]，這說明增加的氧化應激水平介導了細胞的炎癥反應。溫和的炎癥反應對于免疫是必需的，但促炎細胞因子的過度表達通常會誘發病理學促炎反應的發生[16]。臨產前后奶牛氧化應激水平較高時，中性粒細胞的呼吸爆發能力、吞噬作用、遷移速率均顯著降低[19]。機體免疫系統的失衡引起炎癥反應加強，更易誘發氧化應激，最終形成惡性循環。

2 硒對奶牛氧化應激及炎癥反應的調節作用及其機制

2.1 對奶牛氧化應激與炎癥反應的調節作用

機體具有周密的抗氧化系統，可以中和、代謝并延遲氧化物的產生?？寡趸瘎┌▋仍葱悦福鏕Px、TrxR、過氧化氫酶(CAT)及血紅素加氧酶(HO)等。此外，非酶促抗氧化劑也是發揮抗氧化作用的重要部分，包括飼糧來源的微量礦物質(硒、銅、鋅)、多酚、維生素(A、C、D和E)以及維生素A前體物β-胡蘿卜素[20]。酶和非酶抗氧化劑協同保護細胞免受自由基誘導的氧化損傷。硒是重要的飼糧抗氧化劑來源，可以通過直接的抗氧化作用以及增強免疫力來有效對抗氧化應激，進而預防奶牛疾病的發生[21]。研究表明，單獨補加硒可以降低產犢期奶牛乳房炎癥感染率并減少含較高體細胞數的乳區比例[22]，改善泌乳中期奶牛血液及牛奶中抗氧化及免疫指標[4]。Warken等[23]給予圍產期奶牛亞硒酸鈉肌肉注射后發現，牛奶體細胞數及ROS含量下降，SOD活性顯著升高，緩解了奶牛氧化應激。體外研究也得出了類似的結果，硒可以促進BMEC的抗氧化功能，SOD、GPx、TrxR、CAT等抗氧化酶活性升高，減緩了過量自由基誘導的氧化應激[4,24]，但其機制并不清楚。

2.2 減緩奶牛氧化應激與炎癥反應發生的機制

2.2.1 通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ/核因子相關因子E2(PPARγ/Nrf2)上調硒蛋白酶的表達

作為硒蛋白酶的組成成分，硒可以調節硒蛋白酶的活性，進而保護機體組織免受氧化損傷，調節抗氧化與免疫功能等；其中，TrxR和GPx是奶牛相關研究較多的與抗氧化有關的硒蛋白。Weiss[25]總結發現，硒或酵母硒可以顯著提高紅細胞中GPx的活性，改善奶?？寡趸δ?。Guo等[8]研究也發現，硒代蛋氨酸可以促進BMEC的生長并上調硒蛋白TrxR1及GPx1基因及蛋白的表達。Nrf2是對氧化還原反應敏感的轉錄因子，控制編碼多種抗氧化及細胞保護相關蛋白的基因轉錄，如GPx、TrxR、HO、SOD等酶的合成。正常生理狀態時，Nrf2被錨定在細胞漿內處于抑制狀態；發生氧化應激時，Nrf2移位入細胞核，啟動下游抗氧化基因及一系列Ⅱ相解毒酶的轉錄，從而發揮強大的抗氧化作用[26]。Gessner等[27]研究表明，從奶牛妊娠后期到泌乳啟動的過渡時期，由于抗氧化活性降低，激活內源性調節，導致Nrf2靶基因的表達上調，促進了抗氧化酶的表達，以提高機體的抗氧化能力。奶牛肝臟中的未折疊蛋白反應在這個時期被激活，導致Nrf2通過蛋白激酶R樣內質網激酶通路被激活[28]，從而促進了抗氧化酶的表達并提高了抗氧化能力。這種內源性調節機制可能也解釋了過多的抗氧化劑補充反而會損害抗氧化能力的事實[26]，大量抗氧化劑可能通過過度抑制Nrf2激活損害機體抗氧化能力。本課題組的研究結果也表明，在氧化應激條件下，添加硒可以激活Nrf2的表達，從而上調其下游TrxR等抗氧化酶的表達，抑制NO誘導的BMEC氧化損傷及炎癥反應[14]。

PPARγ不僅是乳脂調控的重要轉錄因子，對奶牛氧化應激與炎癥反應也起到了良好的保護調控作用。研究表明，PPARγ可以調節Nrf2，小鼠肺部Nrf2的表達在PPARγ抑制后顯著下降[29]。補加硒可以顯著增加BMEC內PPARγ與Nrf2的表達，但PPARγ的抑制降低了Nrf2的基因表達，降低了TrxR、SOD和CAT等抗氧化酶的活性，iNOS活性和炎癥因子的含量呈相反的變化趨勢，因此降低了抗氧化功能；而且當PPARγ被抑制，硒對NO過量誘導的細胞氧化應激的預保護作用被抑制[30]。因此，硒可以通過調控PPARγ/Nrf2進而對機體起到良好的抗氧化保護作用。

2.2.2 通過PPARγ/GPx-核轉錄因子-κB(NF-κB)抑制過量NO的生成

NF-κB是參與免疫功能調控的重要信號通路，受到細菌、ROS、LPS等因素的刺激，NF-κB上的p65亞基就會與抑制蛋白解離，并經移位后進入到細胞核中，與靶基因上的相應位點結合[31]。研究表明，脂多糖(LPS)顯著誘導BMEC中NO的過量產生，并激活了NF-κB信號通路[32]；然而，硒的添加顯著抑制了LPS誘導NF-κB的核轉錄，降低了NO及促炎因子的產生[33]。石惠宇[32]發現，添加白細胞介素-1(IL-1)受體拮抗劑可以抑制BMEC中iNOS的表達和NO的釋放，說明了白細胞介素-1β(IL-1β)對NO過量釋放的介導作用。過量NO誘導的奶牛外周血單個核細胞的氧化應激引起NF-κB通路磷酸化水平增強，上調了腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1β等細胞因子的基因與蛋白表達，而IL-1β的釋放可以介導iNOS的表達，進而引起氧化應激[34]；核轉錄因子-κB p65(NF-κB p65)沉默后，iNOS的表達顯著下降，促進了細胞抗氧化應激能力，降低了炎癥因子的產生[35]。硒添加通過增強全血GPx1的活性緩解了母牛的炎癥反應[23]。硒蛋白如TrxR和GPx可調節炎癥反應相關信號通路，進而抑制不可控炎癥誘發的免疫病理過程。研究發現，BMEC中GPx1的過表達可以下調NF-κB p65活性及核易位，抑制其磷酸化激活[32]。相反地，GPx1基因沉默后，激活了BMEC中NF-κB信號通路，增加了下游炎癥因子的活性及基因表達量，iNOS活性及其基因表達與NO的生成量增加，細胞的抗氧化功能降低[30]。NF-κB信號通路的活化及核轉錄也可以通過過表達GPx4進行抑制[36]。這些研究結果說明，硒通過GPx-NF-κB減緩了奶牛乳腺氧化應激及炎癥的發生。NF-κB通路還受到PPARγ的調節，當PPARγ被抑制，NF-κB信號通路激活，下游IL-1β等炎癥因子及iNOS表達量升高，NO含量增加，導致氧化應激水平升高；然而，硒的添加逆轉了上述氧化損傷，這說明硒通過PPARγ/GPx-NF-κB抑制了過量NO的生成，減緩了奶牛乳腺氧化應激的發生[30]。

2.2.3 通過TrxR-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途徑抑制過量NO的生成

TrxR、Trx及NADPH構成了硫氧還蛋白系統[5]，其中Trx具有氧化型(Trx-S2)和還原型[Trx(SH)2]2種形式，其氧化還原調節功能是通過二硫鍵和巰基的互變來實現的[37]。研究發現，補充有機硒可增強奶牛血液中硒蛋白TrxR的活性[4]，上調BMEC中TrxR的基因表達及其酶活性，抑制LPS誘導的BMEC內TNF-α、IL-1、白細胞介素-6(IL-6)的蓄積[38]。研究表明，TrxR1活性受到抑制后，iNOS的蛋白表達顯著增加，其活性也伴隨增加，進而誘導NO的過量產生[39]，并進一步轉化為毒性更強的過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)[40]。siRNA靶向沉默TrxR基因表達試驗也進一步說明了硒蛋白TrxR對BMEC及奶牛內皮細胞過氧化損傷的保護作用[39,41]。這提示硒通過促進TrxR活性下調了下游炎癥因子及NO的過量產生。

MAPK家族包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)，也是重要的與氧化還原密切相關的通路。H2O2、細胞因子及其他應激因素導致的激活蛋白-1的激活主要受到JNK及p38MAPK通路的調節[42]。細胞凋亡信號激酶-1(ASK-1)是MAPK信號通路的中間體，可以激活下游促炎癥和促凋亡細胞信號級聯，哺乳動物Trx(SH)2是ASK-1激酶的活性抑制劑，也是依賴ASK-1表達的基因的負調節因子[43]，兩者之間具有高度的依賴性。Trx(SH)2與ASK-1的N端區域結合，抑制其活性，當BMEC發生氧化應激時，TrxR活性下降，ASK-1被激活，進而導致p38MAPK和JNK磷酸化，通路活性被激活[16]。MAPK信號通路的激活可以進一步誘導NF-κB通路的活化，進而促使IL-1β等炎癥因子的大量產生，導致NO等自由基的大量釋放；過量釋放的自由基反過來又誘導MAPK信號通路的激活，并刺激NF-κB的進一步活化，形成惡性循環，最終誘發不可控的炎癥反應，導致機體損傷[44]。然而，硒的添加可以抑制金黃色葡萄球菌或過量NO誘導的BMEC內p38MAPK、JNK、ERK1/2以及NF-κB的激活，進而下調炎癥因子的表達[14,45]。研究表明，SB203580、SP600125分別抑制了由DNCB引起的p38MAPK、JNK信號通路的磷酸化水平的升高，抑制了其通路活性，IL-1的生成及其基因表達顯著下降，降低了NO的生成；相反，過表達TrxR1基因顯著降低了p38MAPK、JNK通路的基因表達與磷酸化水平及其下游IL-1β和iNOS的基因與蛋白表達，減緩了NO誘導的氧化損傷[39]。這些研究結果進一步說明，硒通過促進TrxR1的表達，抑制了MAPK信號通路的激活，減緩了NO誘導的細胞氧化損傷。

2.2.4 通過TrxR-MAPK/硒蛋白-LOX/COX調節ARA

ARA的大量釋放也與細胞氧化應激密切相關。ARA通常以磷脂的形式存在于細胞膜上，在磷脂酶C、磷脂酶A2(PLA2)2種酶的催化作用下，分解為游離的ARA[46]。研究發現，二硝基氯苯抑制TrxR活性后，MAPK信號通路中ASK-1的活性及其下游p38MAPK和JNK的磷酸化水平顯著加強，通路下游底物cPLA2被磷酸化激活，促進了ARA的釋放，過多的ARA會誘導BMEC中ROS的蓄積[47]。而硒的添加使BMEC中TrxR活性顯著升高，逆轉了二硝基氯苯誘導的氧化應激及對TrxR的抑制作用，Trx(SH)2與ASK-1結合阻礙了MAPK通路的進一步激活及下游cPLA2誘導的ARA及其相關代謝產物在BMEC中的過量蓄積[47]。ARA經LOX、COX、細胞色素P450單氧化酶、非酶氧化4條途徑分別代謝生成不同的具有生物活性的代謝產物，包括前列腺素、血栓素A2、白三烯等[48]。5-LOX和白三烯A4水解酶是ARA代謝產生類花生四烯酸的2個限速酶，硒可以下調上述2個限速酶進而減少類花生酸類物質的產生，從而降低其促炎作用[49]。某些硒蛋白，如GPx1、GPx4可以調節COX/LOX的表達，進而有效控制細胞內氧化還原狀態[50-51]。因此，硒還可以通過調節硒蛋白的表達調節ARA的代謝，以緩解氧化應激。

3 小 結

本文從硒蛋白、Nrf2、MAPK及NF-κB信號通路4個方面論述了硒對奶牛乳腺氧化應激及炎癥反應的緩解作用及其機制。從妊娠到泌乳的過渡期，奶牛需要適應機體快速代謝，在飼糧中補加硒是奶牛代謝需求增加時增強抗氧化防御機制及免疫功能并維持健康的重要手段。然而，對于多種硒蛋白及其他中間硒代謝物在乳腺氧化應激反應和宿主免疫中的作用以及信號通路間的相互作用知之甚少，還需要進一步探究。