基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的八珍湯治療手術(shù)后貧血作用機制研究

韓錚，蔣科衛(wèi)，趙秉元，李潤民，邰耀

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 望京醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)二科，北京 100102

貧血（anemia）是大型手術(shù)后較常見的癥狀，世界衛(wèi)生組織定義貧血的診斷為成年男性血紅蛋白（HGB）＜130 g·L-1，成年女性HGB＜120 g·L-1。中國圍手術(shù)期血液管理研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)置換術(shù)后貧血發(fā)生率達80%以上[1]，脊柱手術(shù)后貧血平均發(fā)生率同樣高達80%[2]。術(shù)后貧血（postoperative anemia）發(fā)生的主要原因包括3點：1）手術(shù)中失血量過大；2）術(shù)后營養(yǎng)攝入不足；3）術(shù)前貧血[3]。西醫(yī)對貧血的治療以應(yīng)用氨甲環(huán)酸注射液、自體血液回輸、異體輸血、營養(yǎng)支持為主要手段[4-7]。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥參與術(shù)后貧血的治療越來越多。術(shù)后貧血符合中醫(yī)學(xué)中“虛勞-血虛”的特點。八珍湯出自《瑞竹堂經(jīng)驗方》，是中醫(yī)治療氣血虧虛的經(jīng)驗名方，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、當歸、白芍、川芎8 味藥物組成。徐凱捷等[8]在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，加味八珍湯可以提高類風濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)置換后的血紅蛋白含量及消除下肢腫脹。文獻研究表明，八珍湯可以改善股骨近端髓內(nèi)釘（PFNA）術(shù)后貧血，提高血紅蛋白及紅細胞比容[9]，治療癌性貧血[10]及腎性貧血[11]。但目前對于八珍湯治療術(shù)后貧血的作用機制研究少有報道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選八珍湯中藥物的有效成分，構(gòu)建“疾病-靶點-成分”網(wǎng)絡(luò)，尋找八珍湯治療術(shù)后貧血的主要蛋白及通路，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 八珍湯各成分及靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[12]分別檢索八珍湯中8味藥物人參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、當歸、白芍、川芎的有效化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18進行成分篩選。將篩選出的有效化學(xué)成分與UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）中蛋白質(zhì)進行匹配，得到八珍湯化學(xué)成分可能的靶點蛋白及基因。

1.2 術(shù)后貧血相關(guān)靶點篩選

以“postoperative anemia”為關(guān)鍵詞分別檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd），進行疾病相關(guān)基因的查詢與靶點預(yù)測，將全部數(shù)據(jù)錄入Excel表格中整理，刪除重復(fù)值，確定最終疾病靶點信息。

1.3 藥物疾病共同靶點預(yù)測

利用Venny 軟件將八珍湯成分靶點和術(shù)后貧血靶點取交集，得到共同作用靶點，使用繪圖軟件Cytoscape 3.7.0 構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果進行可視化處理。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

利用STRING 11.0 網(wǎng)絡(luò)平臺（https://string-db.org）[13]構(gòu)建共同作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將Organism設(shè)置為Homo sapiens 進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖，最低相互作用閥值設(shè)置為0.4，隱藏游離靶點，確保數(shù)據(jù)真實可靠。將數(shù)據(jù)結(jié)果分別以TSV 和PNG 格式導(dǎo)出。應(yīng)用Perl腳本得到核心靶蛋白。

1.5 基因本體（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路構(gòu)建

運用R 3.6.3 對疾病與藥物共有靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路構(gòu)建分析，設(shè)置P＜0.05，得到顯著通路圖。

2 結(jié)果

2.1 八珍湯有效成分

通過TCMSP 檢索符合OB 值和DL 值的有效成分，獲得八珍湯有效成分共160個，其中人參22個、白術(shù)7 個、茯苓15 個、當歸2 個、川芎7 個、白芍13 個、熟地黃2 個、甘草92 個，刪除重復(fù)項后最終獲得符合條件的有效化學(xué)成分150 個，其中DL 值排名前20位的有效化學(xué)成分見表1。

表1 八珍湯活性成分（DL值排名前20位）

2.2 八珍湯與術(shù)后貧血共同作用靶點

將八珍湯150 個有效成分與UniProt 數(shù)據(jù)庫進行匹配，得到相關(guān)蛋白基因數(shù)據(jù)，其中熟地黃29 個、人參193 個、甘草1255 個、茯苓22 個、當歸52 個、川芎31 個、白術(shù)18 個、白芍61 個，刪除重復(fù)靶點后最終獲得八珍湯有效成分靶點216 個。通過GeneCards、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫進行搜索，刪除重復(fù)靶點后獲得“postoperative anemia”相關(guān)基因靶點共1832 個。通過Venny 繪圖軟件得到疾病與藥物共同作用靶點，如圖1所示，其中包括一氧化氮合酶2（NOS2）、雌激素受體1（ESR1）、雌激素受體2（ESR2）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1（PTGS1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）等。

圖1 八珍湯-術(shù)后貧血相關(guān)靶點韋恩圖

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape 3.7.0 軟件將獲得的共同作用靶點繪制八珍湯治療術(shù)后貧血的疾病-靶點-成分網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性，度（degree）值越大，表明經(jīng)過該結(jié)點連線越多。分析結(jié)果表明，度值較高的前10個靶點依次為PTGS2、ESR1、雄激素受體（AR）、NOS2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、糖原合成酶激酶3（GSK3B）、ESR2、結(jié)締組織生長因子（CCN2）、鈉通道、電壓閥門Vα（SCN5A）。有效成分中度值排名前5 的依次為槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查耳酮a、7-甲氧基-2-甲基異黃酮。

圖2 八珍湯治療術(shù)后貧血的疾病-靶點-成分網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING 11.0 在線軟件，導(dǎo)入術(shù)后貧血與八珍湯的共同作用靶點，將medium confidence 設(shè)置為0.4，隱藏去除游離靶點，最終得到140 個節(jié)點、2625 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點平均度值為37.5。將圖片以PNG 格式導(dǎo)出，見圖3。數(shù)據(jù)以TSV 格式儲存，應(yīng)用R 語言腳本對所得數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計，相鄰節(jié)點數(shù)排名前20 位的靶點見圖4。結(jié)果表明，八珍湯可能通過作用于蛋白激酶B1（Akt1）、白細胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）等蛋白改善術(shù)后貧血。

圖3 八珍湯治療術(shù)后貧血PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 八珍湯治療術(shù)后貧血PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白

2.5 GO功能分析

GO 富集結(jié)果顯示，八珍湯治療術(shù)后貧血的可能作用過程有152 條，包括影響細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、DNA-RNA 轉(zhuǎn)錄過程、血紅素結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、血小板衍生生長因子結(jié)合等。富集基因顯著性排名前20位的GO富集條目見圖5。

圖5 八珍湯治療術(shù)后貧血GO富集分析

2.6 KEGG通路分析

KEGG 分析最終得到168條可能通路，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 信號通路、MAPK信號通路、細胞衰老、細胞凋亡、C型凝集素受體信號通路、IL-17 信號通路、Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體信號通路、造血細胞系、癌癥中的microRNAs、前列腺癌、甲型流感、EB（epstein-barr）病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、內(nèi)分泌抵抗、麻疹等。按基因富集顯著性排名前20 位的通路見圖6。

圖6 八珍湯治療術(shù)后貧血KEGG通路分析

3 討論

術(shù)后貧血的發(fā)生是術(shù)后并發(fā)癥出現(xiàn)的高危因素，可導(dǎo)致術(shù)后感染率和死亡率升高[14-15]，影響患者肢體功能活動[16]及術(shù)后生活質(zhì)量[17]等。中醫(yī)學(xué)認為，手術(shù)創(chuàng)傷造成血溢脈外、氣隨血脫，導(dǎo)致術(shù)后患者少氣懶言、食欲不振、面色恍白、脈虛弱等癥狀。八珍湯由四物湯和四君子湯組合而成，具有健脾益氣、補血等功效。方中人參和熟地黃共為君藥，具有益氣養(yǎng)血的功效；茯苓和白術(shù)為臣藥，健脾益氣；當歸和白芍補血和營；川芎為佐藥，行氣活血；甘草為使藥，調(diào)和全方。諸藥合奏，達到補而不膩的功效。甘鋒平等[18]的臨床研究結(jié)果表明，老年患者髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后口服八珍湯，其血液中血紅蛋白、人血清白蛋白與對照組有明顯差異。王官林等[19]研究發(fā)現(xiàn)，八珍湯可有效提高老年患者術(shù)后紅細胞和血紅蛋白指標。高依卿等[20]研究發(fā)現(xiàn)，八珍湯可促進大鼠和小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生集落因子（CSFs），從而改善血液指標。陳玉春等[21]研究表明，八珍湯可提高小鼠血清促紅細胞生成素（EPO）水平，可能通過此種方式增加造血。

本研究結(jié)果顯示，根據(jù)OB、DL 值篩選出八珍湯活性成分相關(guān)靶點216 個，術(shù)后貧血相關(guān)靶點140 個。八珍湯中可能與術(shù)后貧血相關(guān)的有效成分為槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查耳酮a 等。相關(guān)研究顯示，槲皮素可促進大鼠腎臟生成和釋放EPO，從而改善貧血[22]。山柰酚具有抗癌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、保護損傷組織、參與免疫調(diào)節(jié)等作用[23]，對術(shù)后恢復(fù)具有一定促進作用。柚皮素具有抗血小板聚集作用[24]，有一定的抗血栓功效。甘草查耳酮a 具有抗癌、抗炎、抑菌、抗氧化等作用[25]。此結(jié)果表明，八珍湯可從多種途徑改善術(shù)后貧血，可降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，Akt1[26]、IL-6[27]、VEGFA[27-28]、MAPK[29]等都具有與貧血相關(guān)聯(lián)的表達。八珍湯可能通過調(diào)節(jié)Akt1、IL-6 的表達調(diào)節(jié)造血細胞的增殖、分化和凋亡；通過調(diào)節(jié)VEGFA表達促進血管內(nèi)皮細胞的分化和凋亡，進而改善貧血。同時部分基因也與腫瘤表達相關(guān)聯(lián)，表明八珍湯在治療腫瘤方面具有一定的潛能。

GO 功能富集結(jié)果顯示，八珍湯具有改善受體配體活性的功能，同時也有促進血色素結(jié)合的功能。KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，這些作用與MAPK、PI3K-Akt通路相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 通路存在細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、ERK5、NK、p38/MAPK 分支路線，前兩者參與細胞的生長和分化，為機體提供營養(yǎng)支持，后2 種分支路線可抑制炎癥反應(yīng)和細胞的凋亡[30]。AGE-RAGE 通路與創(chuàng)面愈合修復(fù)相關(guān)，涉及多種細胞因子[31]。PI3K-Akt 通路可參與多種生物進程，其持續(xù)的活化可導(dǎo)致白細胞的持續(xù)增生[32]，表明八珍湯可能通過該通路提高機體免疫力。同時也有研究顯示，該條通路可調(diào)節(jié)促紅細胞增殖內(nèi)皮祖細胞，降低內(nèi)皮祖細胞的凋亡[33]。同時KEGG 研究發(fā)現(xiàn)多條與腫瘤相關(guān)通路，與PPI 網(wǎng)絡(luò)分析相互結(jié)合，說明八珍湯在抗腫瘤方面有一定的潛力。從中醫(yī)學(xué)角度分析，腫瘤的臨床表現(xiàn)與術(shù)后貧血類似，均存在正氣不足、體質(zhì)虛弱，在治療原則上具有類似的治法。此結(jié)果也表明，中藥具有異病同治的特點。在白芍治療貧血的作用機制研究中發(fā)現(xiàn)，負調(diào)控脂質(zhì)存儲可能為白芍治療貧血的關(guān)鍵通路，細胞-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可能為關(guān)鍵途徑；KEGG 研究發(fā)現(xiàn)，IL-17通路、AGE-RACE 通路、TNF 通路可能為關(guān)鍵通路[34]，說明白芍與八珍湯治療貧血存在相似之處。

本研究結(jié)果表明，八珍湯可通過多種成分作用于多途徑，發(fā)揮治療術(shù)后貧血的作用。但目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究只能分別對藥物有效成分進行研究分析，在對于中藥煎煮時高溫加熱導(dǎo)致部分蛋白變性及中藥之間可能發(fā)生的相互化學(xué)反應(yīng)暫時無法預(yù)測。在今后的研究中仍需要進一步完善。