Box-Behnken效應面法優化粗榧葉總黃酮提取工藝及其體外活性研究△

李思齊，余學英，何芳

十堰市太和醫院（湖北醫藥學院 附屬醫院）藥學部，湖北 十堰 442000

粗榧Cephalotaxus sinensis又名中國粗榧、粗榧杉，為三尖杉科三尖杉屬植物，是著名觀賞樹種，屬國家珍貴樹種[1]，分布于我國甘肅、云南、貴州、廣東、福建、湖北、安徽等地[2]。粗榧的葉、枝、根、種子均可入藥，其中，葉四季均可采用，種子11 月份采用。粗榧因具有較強的抗癌作用，而被稱為“抗癌奇木”[3]。研究發現，粗榧中主要含有生物堿類[4-5]、黃酮類[2,6]、內酯類[7]、苯丙素類[8-9]、二萜類[10]等成分。粗榧的研究多集中在生物堿類成分，黃酮類成分的研究較少。目前，對粗榧葉總黃酮的提取多采用正交設計優化其工藝[11]，但正交試驗法得到的回歸模型精度與預測性較差，直觀性差[12]，而采用響應面法優化粗榧葉中總黃酮的超聲提取工藝尚未見報道。本研究擬采用Box-Behnken效應面法對超聲法提取粗榧葉中黃酮的工藝進行優化，并探討其抗氧化活性，以期為粗榧的進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

GPD-1000C 型中藥材粉碎機（臺州國品樂機機械有限公司）；BP211D 型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2550 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

粗榧葉購自祁州藥材堂，經十堰市太和醫院陳吉炎教授鑒定為三尖杉科植物粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehder et E.H.Wilson) H.L.Li 的干燥葉。對照品蘆丁（批號：wkq20030203，四川省維克奇生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基（批號：20200429，上海寶曼生物科技有限公司）；維生素C（VC，批號：20200105，上海寶曼生物科技有限公司）；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號：20200624，上海寶曼生物科技有限公司）；乙醇（批號：20191106，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的建立

采用60%乙醇，超聲溶解，制成質量濃度為1.0 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。參考文獻[13]，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法于510 nm 處測定其吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標（X），吸光度值為縱坐標（Y），制備標準曲線，回歸方程：Y=6.003 2X-0.003，r=0.999 7。

2.2 總黃酮得率的計算

稱取粗榧葉粉末1.0 g，置于具塞瓶中，加入一定量的適宜體積分數的乙醇，超聲法提取黃酮，濾過，獲得的上清液即得到粗榧葉總黃酮的提取液。精密量取0.5 mL 濾液置于25 mL 量瓶中，按2.1 項下方法，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法，于510 nm處測定吸光度，并計算粗榧葉總黃酮的得率。

式中，C為根據2.1項下獲得回歸方程計算的提取液中總黃酮的質量濃度（mg·mL-1），V為提取液定容后的最終體積（mL），n為稀釋倍數，m為粗榧葉樣品的質量（g）。

2.3 超聲提取工藝優化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 乙醇體積分數對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定超聲時間40 min，液料比為30∶1，考察不同乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結果見圖1。隨著乙醇體積分數的增加，粗榧葉總黃酮得率呈先升高后緩慢下降的趨勢，當乙醇體積分數為60%時，總黃酮得率最高。這可能是因為乙醇體積分數為60%時，提取溶劑極性與粗榧葉中總黃酮相似，有利于總黃酮的溶出，乙醇體積分數超過60%時，醇溶性雜質溶出增加，影響黃酮的溶出。故選擇乙醇體積分數60%作為后續總黃酮提取工藝優化的參數。

圖1 乙醇體積分數對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.1.2 超聲時間對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數60%，液料比為30∶1，考察不同超聲時間（20、30、40、50、60 min）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結果見圖2。隨著超聲時間的延長，粗榧葉總黃酮得率呈現先升高后緩慢下降的趨勢，當超聲時間為40 min 時，總黃酮得率最高。這可能是因為超聲時間短，黃酮沒有完全溶出。超聲時間為40 min 時，黃酮基本完全溶出，提取率最高。故選擇超聲時間40 min 作為后續總黃酮提取工藝優化的參數。

圖2 超聲時間對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.1.3 液料比對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數60%，超聲時間40 min，考察不同液料比為（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結果見圖3。液料比增加，粗榧葉總黃酮得率呈現先升高后下降的趨勢，當液料比為30∶1 時,總黃酮得率最高。這可能是因為液料比較高時，粗榧葉中黃酮與溶劑接觸不完全，隨著液料比的降低，黃酮溶出速度加快，當液料比為30∶1 時，黃酮的溶出達到飽和，提取率達到最大；液料比超過30∶1 時，增加了雜質的溶出，不利于總黃酮的提取。故液料比30∶1 作為后續總黃酮提取工藝優化的參數。

圖3 液料比對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.2 Box-Behnken 效應面法優化方案設計 依據單因素試驗的結果，以粗榧葉總黃酮得率為響應值，乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）、液料比（C）為自變量，利用Design-Expert 軟件進行Box-Behnken設計，對粗榧葉總黃酮提取工藝進行優化。試驗因素與水平見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken響應面法優化粗榧葉總黃酮提取的因素與水平

表2 Box-Behnken響應面法優化粗榧葉總黃酮提取的試驗設計

2.3.3 回歸方程的建立及顯著性分析 根據Box-Behnken 效應面法試驗結果，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2中的數據進行多元二次回歸，得到二次多項回歸方程：Y=7.336+0.425A+0.343 75B+0.351 25C+0.202 5AB-0.167 5AC-0.235BC-0.868A2-0.590 5B2-0.135 5C2，該模型的決定系數R2=0.978 4，調整系數R2Adj=0.950 6，表明該方程具有較好的預測性；變異系數=2.55%，說明該模型的重現性較好，可用于分析和預測粗榧葉總黃酮的得率。回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，二次回歸模型的F=35.210 15，P＜0.01，表明回歸方程模型差異高度顯著，有統計學意義；失擬項P=0.089 799＞0.05，表明該試驗不存在失擬因素，所選的因素合理。根據P值大小可知，

表3 Box-Behnken響應面法優化粗榧葉總黃酮提取的回歸模型的方差分析

A、B、C、A2、B2對粗榧葉總黃酮得率影響差異有統計學意義（P＜0.01），AB、BC 對粗榧葉總黃酮得率的影響稍弱（P＜0.05），AC、C2的影響差異無統計學意義。從P值大小可知，三因素對粗榧葉總黃酮提取結果的影響順序為A＞B＞C。

2.3.4 響應面分析 交互因素的響應面圖見圖4，響應面圖的最高點就是交互因素的最佳條件[14]。從圖4 可知，乙醇體積分數與超聲時間、超聲時間與液料比的交互因素中的等高線坡度較陡峭，乙醇體積分數與液料比交互因素的等高線坡度較平緩，說明乙醇體積分數與超聲時間、超聲時間與液料比的交互作用對粗榧葉總黃酮的得率影響較大，乙醇體積分數與液料比交互因素對粗榧葉總黃酮的得率影響不顯著，與回歸分析的結果一致，進一步表明所建立的模型較準確。

圖4 各因素的交互作用對粗榧葉總黃酮得率影響的響應面圖

2.3.5 最佳提取工藝和預測結果驗證 由擬合的響應面形狀和已建立的回歸模型得到粗榧葉總黃酮的最佳提取工藝：乙醇體積分數61.92%，超聲時間41.76 min，液料比37.11∶1，此條件下粗榧葉總黃酮的預測提取率為7.56%。為使試驗便于操作，將最佳提取工藝修正為乙醇體積分數62%，超聲時間42 min，液料比37∶1。按照修正后的最佳提取工藝驗證實驗，粗榧葉總黃酮得率為（7.51±0.13）%，接近預測值，表明用Box-Behnken響應面法所建立的模型可靠，可用于粗榧葉總黃酮提取條件的優化和結果預測。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力的測定 清除DPPH自由基的試驗參照申夢娜等[15]的方法，并做如下修改：2 mL 現配的DPPH 溶液分別與2 mL 的不同質量濃度的粗榧葉總黃酮提取液進行混合，于室溫下避光保存30 min，在516 nm 波長下測定吸光度。以VC為陽性對照，按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中，A0為DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度；A1為不同濃度的粗榧葉總黃酮提取液與DPPH混合液的吸光度；A2為不同濃度的粗榧葉總黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度；C為DPPH 自由基清除率。

2.4.2 ABTS 自由基清除率測定 參照何珊等[16]的方法，用無水乙醇配置ABTS 溶液，使其在734 nm波長處的吸光度為（0.70±0.02），將粗榧葉總黃酮提取液用無水乙醇稀釋成不同濃度的樣品溶液，以VC作為陽性對照。分別取2 mL 不同濃度的樣品溶液、2 mL 的VC溶液與2 mL ABTS 溶液混合，室溫避光反應10 min，用紫外-可見分光光度儀于734 nm 波長處測定粗榧葉總黃酮的吸光度，按公式（3）計算。

式中，A0為ABTS溶液與無水乙醇混合液的吸光度；A1為不同質量濃度的粗榧葉總黃酮提取液與ABTS 混合液的吸光度；A2為不同質量濃度的粗榧葉總黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度；I為ABTS清除率。

粗榧葉總黃酮提取液抗氧化活性結果見圖5。DPPH 自由基清除實驗表明，粗榧葉總黃酮質量濃度為40 μg·mL-1時，清除率達到平衡，粗榧葉總黃酮的半數抑制濃度（IC50，7.835 μg·mL-1）低于VC的IC50（13.574 μg·mL-1）。ABTS+自由基的清除實驗表明，粗榧葉總黃酮質量濃度為30 μg·mL-1時，清除率達到平衡，粗榧葉總黃酮的IC50（10.551 μg·mL-1）亦低于VC的IC50（16.919 μg·mL-1）。隨著粗榧葉總黃酮提取液質量濃度的增加，清除能力都呈現增加的趨勢，并具有明顯的濃度依賴性，且清除效果優于陽性對照藥VC。表明粗榧葉總黃酮提取液具有較好的抗氧化活性。

圖5 粗榧葉總黃酮提取液抗氧化活性

3 結論與討論

本研究以總黃酮得率為響應值，選用Box-Behnken 效應面法從乙醇體積分數、超聲時間、液料比等方面對粗榧葉總黃酮的提取工藝進行優化，并采用紫外-可見分光光度法對得到的黃酮進行測定，最終得到最佳提取工藝為乙醇體積分數62%，超聲時間42 min，液料比37∶1，粗榧葉總黃酮得率為（7.51±0.13）%，優于劉曉嬌等[11]通過正交設計優化后的工藝獲得的粗榧葉總黃酮（5.91%），且該方法直觀性和與預測性均優于正交設計。

體外抗氧化活性試驗表明，最佳提取條件下得到的粗榧葉總黃酮提取液對DPPH 自由基的清除率稍高于報道，且本研究新增了粗榧葉總黃酮提取液對ABTS 自由基清除率的測定。DPPH 自由基及ABTS 自由基的清除率試驗結果均表明，粗榧葉總黃酮提取液具有較強的抗氧化活性，為天然抗氧化劑的開發提供了新思路，值得進一步的研究開發。