苦水玫瑰ITS及ITS2序列分析與鑒別△

張平，黃聰琳，王曉琳，馬瀟*，楊平榮，鄭健

1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；

2.甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；

3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；

4.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

苦水玫瑰Rosa rugose‘Kushui’屬薔薇科薔薇屬多年生常綠或落葉灌木，是中國玫瑰和鈍齒薔薇的雜交品種，因產地甘肅永登苦水鎮而得名，是一種具有藥食兩用價值的天然植物[1]。玫瑰花蕾低溫干燥用作玫瑰花茶，氣芳香濃郁，具有行氣解郁、消除疲勞、消炎殺菌、調節體質、潤澤肌膚等功效。苦水玫瑰作為藥食兩用的植物，有必要提高其質量標準，以保證使用上的準確和安全。

分子生物學技術的不斷發展為藥材鑒定提供了新的思路，DNA 條形碼技術的應用有利于藥食兩用植物的準確鑒定。本研究按照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部附錄9107“中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導原則”[2]，對苦水玫瑰、平陰玫瑰R.rugosaThunb.、月季R.chinensisJacq.、金邊玫瑰R.Jinbian、法蘭西玫瑰R.gallicaL.的內轉錄間隔區（ITS）及ITS2 序列進行研究分析[3]，并以玫瑰對照藥材作為參照物，利用苦水玫瑰序列的差異性對其進行鑒別，以期從分子水平全面了解苦水玫瑰的序列特征，與其他玫瑰品種進行區分，為培育玫瑰花優良品種提供參考。

1 材料

1.1 樣品與試劑

樣品采自中國甘肅、山東、云南及臺灣，由甘肅省藥品檢驗研究院馬瀟主任藥師鑒定，具體信息見表1。

表1 樣品信息

植物基因組DNA 提取試劑盒、2×TaqMaster Mix、定量Marker（北京天根生物技術有限公司）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 儀器

8000M 型高能量球磨機（美國Spex 公司）；Veriti型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）儀、3730XL型測序儀（美國ABI 公司）；JY600C 型水平電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；ZF-388 型全自動凝膠成像系統（上海嘉鵬科技有限公司）；MS205DU型十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；Pacific RO 型純水儀、Nano Value8000型多樣品-微量紫外分光光度計（賽默飛世爾公司）；Codon Code Aligner 3.7.1序列拼接軟件（美國Codon Code公司）。

2 方法

2.1 樣品總DNA的提取

稱取供試品20 mg，每個供試品平行取樣2 份，利用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA。微量紫外分光光度計測定DNA濃度。

2.2 PCR反應擴增

ITS 序列擴增引物正向為ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向為ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；ITS2 序列擴增引物正向為ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向為ITS3R：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'。采用20 μL 反應體系，包括DNA 模板3 μL（1 μL 約50 ng）、2×TaqMaster Mix 緩沖液10 μL、正反向引物各0.4 μL 及滅菌ddH2O 6.2 μL。陰性對照不加模板DNA，以滅菌ddH2O 補足體積。擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

配制50×TAE緩沖液（稱取Na2EDTA·2H2O 37.2 g、Tris242g于1 L燒杯中，加入800 mL的去離子水，充分攪拌溶解。再加入冰醋酸57.1 mL，充分混勻。加去離子水定容至1 L，室溫保存），稀釋50 倍得到1×TAE 工作液。制備含顯色劑ExRed（1∶10 000）的1.5%瓊脂糖凝膠，放入水平電泳槽，添加1×電泳緩沖液至沒過膠板，瓊脂糖凝膠點樣槽內加入擴增產物3 μL。設置電壓5 V·cm-1，進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約2 cm 處時，停止電泳。經凝膠成像系統觀察電泳結果并拍照保存。

2.4 PCR擴增產物測序

對照DNA Marker，將電泳結果顯示相對分子質量正確的單一明亮條帶的擴增產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。

2.5 數據處理

測序結果使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對拼接，去除引物區段，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法[4]，去除兩端5.8S 和28S 區段，獲得ITS2 序列。將拼接好的序列于GenBank 上進行比對分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于Kimura 雙參數模型（Kimura-2-parameter，K2P）計算種內及種間遺傳距離，進行barcoding gap分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于K2P 模型，采用臨接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，使用1000 次重復檢測的Bootstrap 值表示樹上各節點的支持率。

3 結果與分析

3.1 電泳結果

取樣品提取DNA 片段，因受到色素等雜質的影響，提取效果不理想，故將樣品分為花瓣和花梗分別粉碎取樣分析，結果表明，花梗類樣品提取的DNA 片段更佳，所受到的干擾小，故選擇用花梗粉末提取DNA 片段，擴增后電泳。為了數據準確性，平陰玫瑰、月季、金邊玫瑰、法蘭西玫瑰均提取了2 份DNA 片段進行電泳分析，玫瑰對照藥材因只有粉末故只提取了1 份，苦水玫瑰按表1 提取了7 份。玫瑰采集樣品與對照藥材ITS 和ITS2 序列的電泳結果見圖1～2，均顯示為單一條帶。ITS 和ITS2 圖中部分電泳點顏色較淺，可能是樣品間存在差異，或提取DNA片段時雜質干擾使片段不純。

3.2 ITS序列測序結果

電泳檢測結果顯示，ITS引物的擴增產物片段大小接近750 bp（圖1），ITS2 引物的擴增產物片段大小接近500 bp（圖2）。ITS引物的擴增產物片段大于ITS2 引物，理論上ITS 引物的擴增產物攜帶更豐富堿基信息和鑒別位點，更適用于區分不同玫瑰品種。但是，測序結果顯示，ITS引物擴增產物中大部分樣品的測序結果雙峰嚴重，無法有效拼接（圖3），可用數據量低，含不確定性堿基比例高，因此無法根據ITS 序列對苦水玫瑰及參考物種進行序列比對與分析。

圖1 樣品ITS序列的PCR擴增電泳圖

圖2 ITS2序列的PCR擴增電泳圖

圖3 6號苦水玫瑰樣品ITS引物擴增產物的測序峰圖

3.3 ITS2序列分析

3.3.1 ITS2 變異位點分析 測序序列使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對拼接，去除兩端5.8S 和28S 區段后，獲得的ITS2 序列位點信息見圖4～5。7 個苦水玫瑰樣品獲得了2 個ITS2 單倍型，分別為6 和8 序列，存在1 個變異位點。苦水玫瑰與其他樣品ITS2 序列長度均為213 bp，且物種序列相近。苦水玫瑰與玫瑰及玫瑰對照藥材存在1～2 個變異位點，與金邊玫瑰和法蘭西玫瑰存在2～3 個變異位點，主要變異區在156～208 bp，見表2。

表2 樣品ITS2變異位點分析

圖4 苦水玫瑰變異位點

3.3.2 ITS2 遺傳距離分析 苦水玫瑰6 與各物種間的平均遺傳距離為0.006 74，苦水玫瑰8 與各物種間的平均遺傳距離為0.011 58。苦水玫瑰種內遺傳距離為0.004 80，苦水玫瑰與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離最遠，其中苦水玫瑰8 與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離達0.014 51。苦水玫瑰6 與玫瑰對照藥材、玫瑰和月季序列的遺傳距離最近，僅為0.004 81，接近苦水玫瑰的種內遺傳距離，見表3。

表3 樣品ITS2遺傳距離分析

圖5 苦水玫瑰與其他物種比較的變異位點

3.3.3 ITS2序列NJ樹聚類分析 利用MEGA 5.0軟件對苦水玫瑰樣品的ITS2 序列分析比對，鄰接法進行聚類分析。聚類分析結果顯示，不同種有明顯區分，不同物種各聚為1 支，其中玫瑰和玫瑰對照藥材的遺傳距離相對接近，聚為1支。而2條苦水玫瑰序列種內存在1 個變異位點，使其分為2 個單支，見圖6。

圖6 基于ITS2序列構建的不同品種玫瑰的NJ系統聚類樹

4 討論與結論

被子植物的ITS 序列長度通常為600～700 bp，在具有高度保守性和穩定性的同時，又有一定的變異性，能夠提供豐富的系統學信息。基于ITS 序列等分子標記的DNA 條形碼鑒定是直接根據物種基因DNA 的多態特征進行的分子鑒定，ITS 序列種內差異＜1%，種間差異為1.2%～10.2%，屬間差異為9.6%～28.8%[5-10]。本研究中，苦水玫瑰及參考物種的ITS 序列測序結果雙峰嚴重，無法進行序列比對與分析。

ITS2 序列相比于ITS 序列具有片段短、易擴增、易測序等優點，對于DNA 已有降解的藥材也有較高的擴增成功率。Chen 等[11]基于6600 余個藥用植物樣本 對matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、ycf5、ITS1、ITS2 序列進行對比研究，結果表明，ITS2 序列的種間準確鑒定率最高，達到92.7%，因此提出將ITS2作為藥用植物的DNA條形碼候選序列。

ITS2序列長度短，大多為200～300 bp，擴增效率高，序列高度保守又具有適合的變異度，本研究收集的部分樣本為飲片，飲片的炮制加工可能會導致樣本DNA 的降解，嚴重影響PCR 擴增效率，因此，選擇序列長度較短的ITS2序列構建系統聚類樹。

實驗用平陰玫瑰與對照藥材的ITS2 序列的質量最高，且序列完全一致，苦水玫瑰的主要序列（序列6 和8）與平陰玫瑰及玫瑰對照藥材相比存在1～2個變異位點，月季、法蘭西玫瑰與平陰玫瑰及玫瑰對照藥材相比存在≥2個變異位點。

苦水玫瑰及其他同屬物種樣品的ITS2 序列相較于ITS 序列更易獲得，且具有相對保守的二級結構，在物種鑒定中具有優勢。對不同品種玫瑰ITS2 序列的變異位點、遺傳距離和NJ 樹聚類等分析表明，利用ITS2 序列能夠有效區分平陰玫瑰、苦水玫瑰、月季、法蘭西玫瑰的樣品。

本研究利用DNA 條形碼鑒定的方法進一步完善了苦水玫瑰的質量標準，為市場中藥材及其混偽品的鑒別提供參考，同時為探討其他物種間的親緣關系提供了新的思路。