三氯生對蚤狀溞急性毒性效應影響

廉潔，吳宇翔，阮鳳嬌，徐國成，陸正和*，蔣琦辰

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港222005；2.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京210017）

三氯生（triclosan），又名三氯新，為羥二乙醚的三氯化衍生物，具有抗菌和消毒作用，廣泛作為個人護理品（牙膏、肥皂、洗液等）和醫用物品（醫用防腐劑、殺菌劑等）的添加劑。近年來，相關研究表明，三氯生具有環境內分泌特性，對動物的生殖具有干擾作用，且在一定條件下可轉化為致癌和致畸物質，其對人類和動物的健康危害已成為研究熱點[1]。

水域生態系統為三氯生的主要污染區域之一，有關三氯生對水生動物的毒性影響主要集中在原生動物、浮游動物和魚類等方面。蚤狀溞是作為生態毒理學常用的浮游動物，有關三氯生對蚤狀溞的毒性影響尚未見報道[2-4]?，F以水體中常見的蚤狀溞為受試動物，研究了三氯生對蚤狀溞的急性致死效應及抗氧化酶等指標影響，獲取蚤狀溞對三氯生敏感性指標，為利用蚤狀溞評價三氯生的毒性作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗所用的蚤狀溞（Daphnia pulex）采自江蘇海洋大學校園池塘，獲得大量幼體后，進行擴大培養。培養使用EPA培養液[5]，餌料使用小球藻（Chlorellasp.），密度為1.0×109cells/L，培養過程中每天換水1次，培養密度為500 mL的培養液中放入30～40個1日齡幼溞，培養溫度為（20±1）℃，光暗比為12 h∶12 h，光強度為18μEm-2。取單個蚤狀溞（F0）進行單克隆，將其所繁殖的第一批及第二批幼體挑出棄掉，當第三批幼體出生時，棄掉母體（F0），以第三批的蚤狀溞為試驗母體（F1），將F1所繁殖的第一批和第二批幼體都棄掉，從第三批開始，按試驗要求，在光照培養箱中進行培養。

1.2 試驗試劑

試驗藥物三氯生（純度99.90%）購于日本巴斯夫公司，用丙酮作為助溶劑，配成20.0 mg/L的母液，后稀釋為試驗測試液。超氧化歧化酶（SOD）活力、過氧化氫酶（CAT）活力、谷胱甘肽轉移酶（GST）活力和丙二醛（MDA）含量測定試劑盒、牛血清蛋白等試劑購于南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性試驗

在預試驗的基礎上，獲得三氯生對蚤狀溞致死最低和最高質量濃度，設置三氯生質量濃度為100，200，400，800和1 200μg/L 5個試驗組，同時設置空白對照組。分別向盛有40 mL測試液的50 mL燒杯內加入不小于1日齡的幼溞10只，溫度為（20±1）℃，以上過程于黑暗條件下進行。測試期間不喂餌料、不換水，48 h后在解剖鏡下觀察幼溞存活情況，以幼溞的心跳停止作為死亡標準。各測試液設4個平行組，統計各測試組中溞的死亡數量，通過幾率單位法計算48 h的三氯生對蚤狀溞的半致死質量濃度（LC50）。

1.4 急性毒性試驗與酶活和MDA含量測定

在獲取48 h半致死質量濃度LC50的基礎上，設置三氯生質量濃度為5，10，20，40、80和160μg/L的6個試驗組并設置空白對照組，選取同一批次且大小一致的1日齡幼溞40只，分別放入盛有上述60 mL測試液的80 mL燒杯中，試驗過程中不投餌，溶解氧質量濃度為5.0 mg/L，以上各質量濃度設4個平行組。

在三氯生處理24和48 h后，于冰上取樣，吸干水分，加入生理鹽水勻漿，4℃冷凍離心10 min后，取上清液測定SOD、CAT、GST活力和MDA含量，測定的方法參照試劑盒說明書，總蛋白含量測定采用考馬斯藍方法，以牛血清白蛋白作為標準品[6]。

1.5 數據分析

試驗結果用平均值±標準差（Mean±SD）表示，運用Sigmaplot 11.0軟件進行分析和作圖。采用單因素方差分析（One-WayANOVA）和Dunnett法對處理組與對照組進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 三氯生對蚤狀溞的48 h急性毒性結果

結果顯示，隨著三氯生質量濃度的增加，蚤狀溞的死亡率呈上升趨勢。在質量濃度為100，200，400，800和1 200μg/L時，蚤狀溞的死亡率分別為7.5%，20.0%，55.0%，92.5%和100.0%，蚤狀溞的死亡率與三氯生質量濃度有明顯的質量濃度效應關系。通過對數據進行Sigmoid 3 parameter擬合得方程y=97.5/[1+e（370.3-x）/115.22]，其中y為死亡率，%，x為三氯生質量濃度，μg/L，得出三氯生對蚤狀溞48 h的半致死質量濃度為370.3μg/L，95%的置信區間為354.2～386.3μg/L（圖1）。

圖1三氯生對蚤狀溞48 h急性毒性

2.2 三氯生對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影響

三氯生對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影響，見圖2（a）（b）（c）（d）。SOD活性測定結果顯示，三氯生對蚤狀溞體內SOD活性具有顯著影響（P＜0.05），蚤狀溞暴露三氯生24 h后，隨著質量濃度增加，SOD活性呈先增加后降低的趨勢。與對照組相比，三氯生質量濃度為10，20和40μg/L時，SOD活性顯著上升（P＜0.05），質量濃度為5和80μg/L時，SOD活性與對照組無顯著差異（P＞0.05），質量濃度為160μg/L時，則出現顯著下降（P＜0.05）；暴露48 h后，SOD活性變化趨勢與暴露24 h后的情況類似，但與對照組相比，三氯生質量濃度為5和10μg/L時SOD活性顯著上升（P＜0.05），質量濃度為20μg/L時SOD活性無顯著差異（P＞0.05），質量濃度為40，80和160μg/L時則出現顯著下降（P＜0.05）。

CAT活性測定結果顯示，三氯生對蚤狀溞CAT活性也具有顯著影響（P<0.05）。蚤狀溞暴露在三氯生24 h后，質量濃度為10，20和40μg/L時，CAT活性與對照組相比顯著上升（P<0.05），但質量濃度為80和160μg/L時，CAT活性顯著下降（P<0.05），質量濃度為5μg/L時，CAT活性與對照組相比無顯著差異（P>0.05）；暴露48 h后，整體上，CAT活性較24 h變化較大。與對照組相比，三氯生質量濃度為5μg/L時，CAT活性無顯著差異（P＞0.05），其他質量濃度下CAT活性的變化趨勢則與暴露24 h時相似。

圖2三氯生濃度對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性和MDA含量的影響

GST活性測定結果顯示，三氯生對蚤狀溞GST活性具有顯著影響（P<0.05）。蚤狀溞暴露于三氯生24 h后，質量濃度為5μg/L時，GST活性表現為顯著上升，質量濃度為10和20μg/L時GST活性雖有下降，但與對照組無顯著差異（P＞0.05），質量濃度在40，80和160μg/L時GST活性顯著下降（P<0.05）；暴露48 h后，除質量濃度為5μg/L時，GST活性與對照組相比顯著上升外（P<0.05），其他質量濃度組均與對照組相比出現顯著下降（P<0.05）。

MDA含量測定結果顯示，暴露于三氯生24 h后，MDA含量隨三氯生質量濃度的升高呈上升趨勢，其中40，80和160μg/L的試驗組MDA含量較空白組出現了顯著上升（P<0.05）；暴露于三氯生48 h后，MDA含量的變化趨勢同暴露24 h時相似，其中20，40，80和160μg/L試驗組MDA含量較空白組出現了顯著上升（P<0.05）。

3 討論

3.1 三氯生對蚤狀溞的急性毒性影響

三氯生的使用對人類健康造成潛在風險，這一直是人們關注的問題，探討三氯生對水生生物的毒性影響可為三氯生的風險評估提供依據，而急性毒性研究是評價有毒物質風險的基礎。已有研究表明三氯生對泥鰍24和48 h的急性毒性LC50值分別為6.60和6.16 mg/L[7]；對東北林蛙48 h的急性毒性LC50值為1.102 mg/L[8]；對大型溞48 h的急性毒性LC50值為390μg/L；對草履蟲48 h的急性毒性LC50值為476μg/L[3]。研究顯示，三氯生對蚤狀溞48 h的急性毒性LC50值為370.3μg/L，結果表明利用蚤狀溞評價三氯生的急性敏感性較以上動物具有明顯優勢。

3.2 三氯生對蚤狀溞主要抗氧化指標的影響

SOD可清除生物細胞內活性氧自由基（Reative Oxygen Species,ROS），在維持細胞ROS的質量濃度平衡中具有重要作用，SOD酶可使機體細胞免受氧化損傷，是機體細胞中抗氧化的關鍵酶。但當外界有毒物質質量濃度過高，導致生物體內ROS上升而又超出SOD酶清除能力時，細胞會受到損傷。因此SOD酶活性改變能及時反映外界有毒物質對溞氧化脅迫的程度[9]。研究中，隨三氯生質量濃度的升高，蚤狀溞體內的SOD活性在低質量濃度試驗組表現出上升，在高質量濃度組則出現下降，暴露24 h后，三氯生質量濃度為5μg/L時，SOD活性無顯著差異，這可能是由于短時間內低毒產生的毒性較少，機體能及時清除ROS，細胞可維持SOD活性的正常，但隨著質量濃度升高或時間延長，三氯生對蚤狀溞毒性加大，整體表現出低促進高抑制的現象。張楠等[9]研究重金屬鋅對大型溞24 h毒性作用和王茜等[10]研究工業廢水對多刺裸腹溞毒性時，SOD和CAT活性變化趨勢均較為相似。在該研究中，三氯生對蚤狀溞體內CAT活性變化趨勢的影響與SOD也較為相似。另外，研究顯示，暴露48 h后，三氯生低質量濃度試驗組（5μg/L），SOD活性較空白組顯著升高，但CAT活性升高不顯著。

GST是生物體內重要的解毒酶，催化谷胱甘肽（GSH）巰基與一些親電物質如脂質過氧化產物及外源性有毒物質結合，以保護DNA，同時避免蛋白質受損。當生物受到輕度毒物污染時，體內的GST會誘導上升，對抗脅迫反應，但污染增加時其誘導作用將被破壞，因此GST常作為環境污染的標記物[11]。研究中，暴露24 h時，除三氯生質量濃度為5.0μg/L時可顯著誘導蚤狀溞GST活性上升，其他試驗組GST活性則出現下降，且在40，80和160μg/L試驗組出現顯著下降；暴露48 h時，各試驗組GST活性均顯著下降，這可能是暴露時間延長或有毒物質量濃度增加，導致過量毒物進入機體，GST與毒性物質大量結合，引起解毒功能下降，在研究鎘類對蚤狀溞影響時[12]，GST活性也出現類似結果，因此GST作為污染物的標記物具有可行性。

MDA為脂質過氧化的最終產物，其含量反映脂質過氧化水平，顯示細胞受損傷程度。研究中，暴露24 h時，MDA含量在三氯生質量濃度為40μg/L時開始出現顯著上升；暴露48 h時，當三氯生質量濃度為20μg/L時，MDA含量即出現上升，這表明三氯生對蚤狀溞MDA含量與其質量濃度和暴露時間有關，這一結果與納米二氧化鈦和銅對大型溞MDA含量的影響相似[13]。

綜上，該研究表明三氯生對蚤狀溞具有一定的毒性，蚤狀溞可通過體內的生化指標對抗脅迫反應，如抗氧化系統中SOD、GST和CAT的活性及MDA含量變化，且GST對三氯生敏感度較其他指標高。利用蚤狀溞評價三氯生毒性效應具有一定優勢，其中抗氧化指標具有快速、敏感性強等特點，該結論對評價三氯生的毒性效應具有一定參考價值。