微血管周細胞及其與糖尿病視網膜病變

邱滿玲 潘銘東 江蕊 徐朝陽 任秉儀 劉光輝

1873年，法國科學家Charles Rouget首次描述了一類從毛細血管壁上分離得來的具有伸縮性呈現透明無色素的細胞，并命名為“外膜細胞(adventitial cells)”[1]。在之后很長的一段時期內，這一類細胞還被賦予了多個名稱，如：“rouget cells”、“intramembranous pericapillary cells”、“mural cells”、“pericapillary cells”、“periendothelial cells”、“perivascular cells”、“deep cells”等。1923年，Zimmermann等采用銀染技術研究了這種細胞，其認為這種細胞：(1)廣泛存在于各種動物的體內毛細血管，如魚類、鳥類、兩棲類、爬行類、哺乳類動物；(2)與動脈及靜脈管壁平滑肌細胞相延續；(3)存在高度分化的細胞亞型，處于不同毛細血管床的細胞包漿突觸明顯不同。Zimmermann將其命名為“周細胞(pericyte)”[2]，這一名稱至今已被廣泛接受并使用。

周細胞是一類相對未分化的細胞，現在一般認為微血管內皮細胞旁的間葉細胞即為周細胞，其包括：(1)束腰樣圍繞毛細血管的收縮、游動的細胞；(2)毛細血管外壁的分支收縮細胞或基底膜外包繞毛細血管前動脈的長收縮細胞；(3)毛細血管或小血管中的相對未分化的細條狀細胞，即外膜細胞；(4)毛細血管平滑肌細胞或包繞毛細血管的寬大扁平伴細長突起的細胞；(5)小血管壁上干細胞樣或間葉細胞樣細胞[3]。

一、周細胞的定位

周細胞位于毛細血管前微動脈、毛細血管、毛細血管后小靜脈及回流小靜脈的管壁。其緊靠微血管內皮細胞，通過突觸等與內皮細胞相連，外圍由基底膜環繞包圍。周細胞、內皮細胞、基底膜三者共同構成微血管管壁(圖1)。其中毛細血管前微動脈、毛細血管后小靜脈的血管周細胞在表型上逐漸向血管平滑肌細胞過渡，被稱為過渡型周細胞。

周細胞的數量在不同的組織器官甚至不同的微血管床中都存在很大的差異。在骨骼肌中，周細胞與內皮細胞的比例約為1:100，腦組織中約為1:4，在視網膜組織中最高，約為1:1[4]。周細胞在毛細血管前小動脈及毛細血管中數量較少，分布稀疏，而在毛細血管后小靜脈及回流小靜脈中數量眾多，密度較高[4]。

二、周細胞的形態

周細胞核呈圓形突起，顯著區別于內皮細胞的細長型核，細胞核周圍由包漿包繞。其胞體發出數個細胞突起，突起逐漸分支變細，包繞微血管管壁，末梢最終延伸到內皮細胞附近，與內皮細胞特征性接觸(圖 1)。通常，每100 μm微血管片段約有90個0.3～0.8 μm寬的突起[4]，毛細血管后小靜脈周細胞的突起較其他位置的周細胞更多。

不同位置的周細胞與微血管接觸的方式各異，其突起具有不同的表型[3]，表現為：(1)細胞突起寬大，扇形樣包繞血管(圖 1a)；(2)細胞突起呈指樣，局限性包繞血管(圖 1b)；

圖1 周細胞在微血管中的位置。周細胞沿著管壁發出大量突觸包繞微血管(圖左)。周細胞位于內皮細胞外側，二者由基底膜包繞，兩細胞間除細胞連接外空隙由基底膜樣物質填充(圖右)；a-d表示不同的周細胞的突觸及形態

(3)周細胞正在遷移，細胞突起呈回縮樣(圖 1c)；(4)周細胞正在縱向遷移，細胞突起沿著血管長軸分布，多見于新生血管(圖 1d)。在正常的微血管中，周細胞表型以包繞型為主。在病理情況下，則遷移型為主。不同表型并非代表著不同的細胞亞型，而是代表不同的功能分化。

在電鏡下觀察[5]，周細胞由基底膜包繞，其細胞核呈扁平狀、圓盤樣，核絕大部分為異染色質，周圍環繞含有細胞器及線粒體的細胞質。細胞質中除基質外，含有高爾基體、內質網等細胞器，內質網以滑面內質網為主。同時，胞質中含有許多突起，內含大量肌絲。肌絲中含有大量的平滑肌肌動蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，及部分非平滑肌肌動蛋白和cGMP依賴性蛋白激酶。新生血管中的周細胞核較常規大，且以常染色體為主，細胞質基質較少，內質網以粗面內質網為主。周細胞內、外表面的細胞膜存在大量的穴樣內陷。在基底膜間隔的區域外，周細胞與內皮細胞彼此間通過嵌合連接(peg-socket contacts)及粘著斑(adhesion plaques)相互連接。

三、周細胞的來源

當前，周細胞的來源還存在一定的爭議。因周細胞與大血管周圍的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells vSMCs)在功能等方面具有的極大相似性，研究認為周細胞與vSMCs屬于同一個細胞系。

周細胞起源的早期研究認為壁細胞源于集結在內皮細胞管近腔側的間充質細胞。然而，大量的細胞世系追蹤研究表明血管系統中成熟的vSMCs有著不同的發展起源，盡管他們在形態及分子標記方面具有一定的相似性。

在主動脈及其鄰近的分支，vSMCs至少存在四種不同的來源——第二心域、神經嵴、體節及臟壁中胚層，這些不同來源的vSMCs呈節段性分布[6]。而頭部包括中樞神經系統在內的絕大部分壁細胞可能源于神經嵴[7]，胸腺的周細胞也來源于此[8]。腸[9]、肺[10]、肝[11]的血管壁細胞起源則歸于間皮系統。心臟的血管壁細胞來源與這些臟器相似。心外膜間皮被認為與心臟間質細胞相關，包括心臟vSMCs和周細胞[12]。這意味著在體腔器官壁細胞發生中，可能存在一個共同的途徑，即間皮細胞經過上皮細胞向間充質細胞轉化、分層、移行進入相應器官, 分化纖維細胞、vSMCs及周細胞等間充質成分。

盡管上述的一類研究已經揭示了一些特定器官的周細胞存在著共同細胞世系，但是周細胞的明確起源還有待進一步研究。

四、周細胞標記物及鑒定

在既往研究中，已經發現了大量周細胞的分子標記物，如α-SMA(平滑肌肌動蛋白-α)、Desmin(結蛋白)、PDGFR-β(血小板衍生生長因子受體-β)、NG2(硫酸軟骨素蛋白多糖4)、CD13 (丙氨酰氨肽酶)、RGS5(G 蛋白信號調節因子5)、SUR2、Kir6.1、DLK1 (穿膜蛋白)、Endosialin及轉基因標記物XlacZ4、NG2 dsRED等[5]。在近年，也還有新的標記物被應用到研究中，如Gli1[13]、Tbx18[14]。

周細胞的標記物在不同的組織器官中表達不同，同時這些標記物的表達水平會隨著周細胞發育、病理狀態及體外培養情況等的變化而波動。Morikawa等發現毛細血管周細胞Desmin表達陽性，但是通常不表達α-SMA，而微靜脈周細胞同時表達Desmin和α-SMA[15]。Kir6.1在部分腦組織血管周細胞中高度表達，但在其他位置幾乎不表達[16]。研究人員還發現，小動脈周細胞與竇狀毛細血管周細胞NG2表達也存在差異[17，18]，甚至還在皮膚中同時發現了NG2陽性和NG2陰性表達的周細胞[19]。

基于周細胞標記物表達的差異性，沒有一種分子標記物能特異標記所有組織中的周細胞。從鑒定角度而言，也并非所有的標記物都具有實際應用價值。目前，細胞體外培養鑒定中常用的經過有效性檢驗的有α-SMA、Desmin、PDGFR-β、NG2、CD13等5種，其特征參見表1。

表1 周細胞常見標記物及其特征

此外，值得一提的是，周細胞與vSMCs功能相近，可能屬于同一細胞世系，但是二者在位置、形態及標記物表達方面還是存在顯著的差異。周細胞形態視分布位置不同而變化，從中型血管到小血管，周細胞可呈現典型vSMCs形態或典型的周細胞形態。周細胞內嵌于微血管內皮細胞基底膜，而vSMCs往往在血管壁中形成單獨的一層結構-中膜。在標記物方面，周細胞不表達平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain SMMHC)和平滑肌22-α(smooth muscle 22-α SM22-α)，此二者在vSMCs中呈陽性表達[20]。

因此，最佳的周細胞鑒定方式應該在組織原位或者切片中進行，鑒定時予以標記2種或以上周細胞標記物，同時標記與之對應的ECs，結合周細胞形態觀察確認。

五、周細胞的功能

周細胞是微血管的重要組成部分，在微血管的病理生理活動中具有重要的作用。其能夠：( 1)調節血管張力及灌注壓從而調控血管血流量[21]。周細胞胞體內含有大量肌絲及收縮蛋白，具有收縮的能力，已有研究證明，周細胞過度收縮引起毛細血管血流受阻在腦部缺血缺氧中扮演了重要的角色[22]，在基因缺陷的小鼠模型中，周細胞缺失的小鼠腦部血流調節能力減弱[23]。周細胞還具有大量血管活性分子的受體，如兒茶酚胺、內皮素-1、加壓素、血管緊張素[24]。Peppiatt等研究顯示，在大量神經遞質刺激周細胞，均能夠引起周細胞的舒展與收縮，改變大腦微血管的直徑，對血流進行調控[25]。 (2)參與生理性及病理性新生血管的形成，調整新生血管的穩定性及結構[26]。新生血管結構的發生、構建、穩定主要由周細胞的募集和分化所推動[26]。微血管的成熟、穩定與管壁周細胞的分布有很大的關系，病理性微血管常常伴有周細胞的缺陷，缺少周細胞的微血管可表現出局灶性擴張、迂曲、微動脈瘤[27]，這種表現在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy DR)中尤為常見。 (3)調控內皮細胞增殖、分化[4]。(4)分泌調控細胞外基質蛋白水平從而影響基底膜的形成[28]。(5)通過調節ECs緊密連接和粘附連接的位置、數量及胞吞轉運的量，調控血管壁通透性[29]。(6)執行吞噬清理功能[23]。

六、周細胞與DR

周細胞凋亡是DR最早的病理特征之一和DR發生的標志，見于DR各個階段及增生性DR中ECs增生性新生血管的病理過程中。既往的臨床研究顯示，DR患者的視網膜微血管周細胞存在數量上的喪失。1996年，Mizutani[30]等報道了在7例糖尿病病程在(9±4)年的患者的視網膜血管消化鋪片中發現大量的周細胞凋亡，而且糖尿病患者的周細胞數量凋亡量遠較非糖尿病患者明顯。另外3例DR患者尸檢報告[31]顯示，DR患者周細胞數量相較ECs減少，通過TUNEL檢測也發現糖尿病患者尸眼較非糖尿病患者尸眼存在大量凋亡細胞及鬼影細胞(周細胞)。Li等[31]據此認為，周細胞凋亡是DR患者周細胞喪失的主要原因。

在模型動物中，Mizutani[30]、Behl等[32]、劉光輝等[33]等分別報道了不同病程期的糖尿病大鼠周細胞凋亡的情況。糖尿病大鼠周細胞凋亡最早可以出現在糖尿病病程的第12周[33]，并且，隨著病程的延長，周細胞凋亡的情況日益嚴重。研究中發現相關的凋亡調節基因的表達，如Bcl-2/Bax等，也發生了變化[34]。

基于非嚙齒類種屬的原代周細胞的體外實驗表明，高濃度葡萄糖能夠誘導周細胞凋亡。Beltramo等[35]報道高糖/低糖快速波動對周細胞的生存能力、粘附能力具有一定的影響，而持續的高糖能明顯誘導周細胞凋亡[34]，同一水平下恒定高糖較高糖波動具有更強的周細胞增生抑制、周期阻滯及誘導凋亡作用[36]。人周細胞對持續高糖的耐受性較牛周細胞高，對高糖/低糖波動更為敏感[37]。持續高糖誘導的周細胞凋亡可能是基于急性的可逆的損害，血糖波動帶來的則是一種累積性的損害，其導致的后果更壞[38]。

當前，高糖誘導周細胞凋亡的具體機制仍不甚清楚，主要可能存在以下生化通路：(1)多元醇通路活動增強；(2)蛋白激酶C激活；( 3)AGEs合成增多；(4)氨基己糖通路活動增強[39]。

醛糖還原酶是一種多元醇通路的關鍵酶，在生理條件下，能將毒性乙醛轉變成不活躍的醛類。然而當機體細胞內葡萄糖過多，醛糖還原酶則將之轉換成山梨醇，期間消耗了大量的NADPH，并引起高糖性缺氧[39]、細胞內氧化應激敏感性提高[40]。細胞內高糖還能通過合成脂質第二信使甘油二酯激活PKC合成[41]，引起內皮細胞一氧化氮合酶合成減少，而內皮素-1、TGF-β、纖溶酶原激活物抑制劑-1[42]及NF-κB合成增加[43]。

此外，細胞內過量的葡萄糖可以通過席夫堿縮合與蛋白質、氨基酸及核酸進行反應。在這種反應初期，其被不可逆性重排為Amadori產物。AGEs可能為自由糖糖氧化產物或活性二羰基片段的產物[44]。AGEs具有一定的毒害性，能夠更改包括調節基因轉錄蛋白在內的細胞內蛋白[45]，或擾亂細胞、影響細胞外基質[46]，致使細胞彼此間粘附能力下降、血管功能失常[47]。也能影響循環血液蛋白，包括各種炎性因子及生長因子產物[48]。

最后，細胞內葡萄糖過高將導致6-磷酸果糖過量，并將其轉換氨基葡萄糖-6-磷酸，繼而UDPN乙酰葡糖胺脫氫酶。后者作用于轉錄因子的絲氨酸和蘇氨酸殘基，引起基因表達上的病理學變化[49]。

雖然當前對DR中周細胞凋亡的可能機制有了一定的認識，但是其確切的凋亡機制仍然有待進一步探索。

七、展望

周細胞是一種微血管壁的成分細胞，其在微血管的生理、病理活動中扮演了重要的角色，并被視為包括DR等視網膜新生血管疾病在內的眾多血管相關性疾病潛在的治療靶點。近年來，周細胞的研究日益受到關注，新的研究擴展了周細胞的傳統定義及人們對其功能的認識。未來繼續探索周細胞的生理、病理功能，深化對周細胞的認識，充分揭示周細胞對微血管生理、病理的調控機制，無疑有助于進一步深化對微血管疾病的系統認識及相關疾病的治療。