江蘇徐州地區(qū)鴨漿膜炎分離鑒定

趙曉錦，王姣，楊海明

摘 要：疫病防控是畜牧生產(chǎn)中非常重要的一環(huán)，漿膜炎癥作為困擾鴨養(yǎng)殖的一種疾病，亟待解決。本研究對(duì)徐州地區(qū)鴨漿膜炎病例進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR鑒定，并對(duì)分離到的11株鴨疫里默氏桿菌和19株大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定。試驗(yàn)結(jié)果明確鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌是引起漿膜炎的主因，徐州地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的主要流行株為Ⅱ型和Ⅰ型，分離到的19種大腸桿菌血清型均不相同。研究結(jié)論為鴨漿膜炎的預(yù)防控制提供參考。

關(guān)鍵詞：櫻桃谷鴨;安全生產(chǎn);漿膜炎;鴨疫里默氏桿菌;大腸桿菌

中圖分類號(hào)：S858.32? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）7-0042-04

疾病是威脅鴨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要因素，鴨傳染性漿膜炎流行廣泛，危害嚴(yán)重，給鴨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。低飼養(yǎng)密度加上良好的衛(wèi)生環(huán)境以及全進(jìn)全出的飼養(yǎng)方式下，鴨傳染性漿膜炎發(fā)病率較低[1]。但近年來(lái)，隨著鴨養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度增大，鴨傳染性漿膜炎的流行率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疫病頻發(fā)造成藥物使用頻繁，盲目用藥導(dǎo)致無(wú)藥可用[3]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告明確剔除了除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種。未來(lái)養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢(shì)必定是減抗，而疫苗的正確選用能夠推進(jìn)減抗發(fā)展。為了推進(jìn)畜牧業(yè)良好技術(shù)的研究和推廣，本文通過探索2019年徐州地區(qū)漿膜炎癥的發(fā)病原因，鑒定鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的血清型，分析徐州地區(qū)流行菌株，為選擇最佳防病防疫程序提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源 江蘇徐州以及周邊地區(qū)自養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 檢測(cè)試劑 胰酪大豆胨瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等試劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌瓊脂粉，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;氯化鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;小牛血清，購(gòu)自平睿生物科技有限公司。2×含染料Taq預(yù)混PCR反應(yīng)體系，StarGreen核酸染料10000×，50×TAE DNA Electrophoresis Buffer，購(gòu)自GenStar北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司。瓊脂糖，購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司。革蘭染液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

試劑均按說(shuō)明書制備要求進(jìn)行配制。

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌上下游引物，由江蘇桂柳牧業(yè)集團(tuán)有限公司提供，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

鴨疫里默氏桿菌血清Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅶ型定型血清，大腸桿菌O血清因子為O78，均由山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。未檢測(cè)出大腸桿菌由江蘇桂柳牧業(yè)集團(tuán)有限公司送外檢測(cè)（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、CX23光學(xué)顯微鏡、TC-96/G/H（b）C基因擴(kuò)增儀、Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)、M1-L213B微波爐、HE-120水平電泳槽、ESP-300水平電泳儀、721N分光光度計(jì)、LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 對(duì)送檢的病死鴨進(jìn)行解剖，取內(nèi)臟和腦進(jìn)行無(wú)菌分離，接種于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨瓊脂平板，置玻璃干燥皿中，皿中放入點(diǎn)燃蠟燭，放在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)。對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行純化，對(duì)疑似鴨疫里默氏桿菌或大腸桿菌的菌落進(jìn)行染色，革蘭染色后使用光學(xué)顯微鏡1000×油鏡下觀察，記錄細(xì)菌形態(tài)。將疑似大腸桿菌的菌落劃在麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置于37 ℃的溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色、形態(tài)。

1.2.2 分子鑒定 取純化后疑似和未鑒定的細(xì)菌作為模板，設(shè)置鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O作為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)體系為10 μM上下游引物（表1）各0.5 ?L、2× Taq PCR StraMix 12.5 ?L、dd H2O 9.5 ?L、模板2 ?L。

PCR反應(yīng)條件設(shè)置為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性 30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫至停止反應(yīng)。

取PCR反應(yīng)產(chǎn)物3 ?L，加入含StarGreen核酸染料的1 %瓊脂糖凝膠板樣品孔中，放入水平電泳儀中，150 V穩(wěn)壓電泳 30 min，凝膠成像處理系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 血清型鑒定

1.2.3.1 抗原制備 取分離純化后的大腸桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，鴨疫里默氏桿菌接種于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，100 ℃水浴2 h，5000 r/min離心20 min，取上清，制備成相應(yīng)的抗原。

1.2.3.2 鴨疫里默氏桿菌血清型鑒定 用生理鹽水配制1.5 %瓊脂板，梅花打孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂，用酒精燈微烤平板底部封底。在中心孔中加入10 ?L鴨疫里默氏桿菌血清，在周圍孔加入10 ?L制備抗原。將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi)，于37 ℃溫箱內(nèi)放置 24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3.3 大腸桿菌血清型鑒定 分別取10 ?L菌體抗原和大腸桿菌O78血清置于玻板上混勻。明顯凝集者為陽(yáng)性，同時(shí)以菌體抗原與生理鹽水混合物作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

2019年從徐州及其周邊接收到剖檢疑似漿膜炎病例32份，有27份分離到疑似鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌菌落，在含5 %小牛血清的胰酪大豆胨瓊脂平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，圓形邊緣整齊，表面光滑，透明，菌落較小，邊緣泛熒光，生長(zhǎng)較慢，在32 h后生長(zhǎng)才較好，判定為鴨疫里默氏桿菌疑似菌落（圖1 A）;圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起，生長(zhǎng)較快，16 h內(nèi)生長(zhǎng)較密，判定為大腸桿菌疑似菌落（圖1 B）。革蘭氏染色后使用光學(xué)顯微鏡1000×油鏡下觀察，鴨疫里默氏桿菌為革蘭氏陰性桿菌，菌體較小，少數(shù)呈雙排列或長(zhǎng)絲狀（圖1 C）。大腸桿菌為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓的短小桿菌，多單在、偶有2～3個(gè)菌體相連（圖1 D），所有疑似大腸桿菌的菌落在麥康凱瓊脂平板上均呈桃紅色（圖1 E），在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上均呈現(xiàn)金屬光澤（圖1 F）。而疑似鴨疫里默氏桿菌在兩種培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。

從徐州市及其周邊搜集到的32份漿膜炎疑似病例檢測(cè)出鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌菌落陽(yáng)性率為84.4 %（27/32）。其中，大腸桿菌和鴨疫里默氏桿混合感染為2例，表明大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌是引起漿膜炎的主要原因。大腸桿菌分離到19例，占相關(guān)病例的59.4 %，且多引起產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋下降，說(shuō)明大腸桿菌對(duì)種鴨的危害大于鴨疫里默氏桿菌，此外，通過臨床剖檢發(fā)現(xiàn)漿膜炎亦是造成鴨腿病的重要致病因素。

2.2 分子鑒定結(jié)果與分析

分別對(duì)11株鴨疫里默氏桿菌菌株及19株大腸桿菌菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中鴨疫里默氏桿菌目的條帶為690 bp，鴨疫里默氏桿菌PCR鑒定結(jié)果見圖2 A;大腸桿菌目的條帶為400 bp，大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果見圖2 B。PCR陽(yáng)性對(duì)照送生工生物工程（上海）股份有限公司檢測(cè)確定為陽(yáng)性。

2.3 血清型鑒定結(jié)果與分析

2.3.1 鴨疫里默氏桿菌血清型鑒定結(jié)果與分析 鴨疫里默氏桿菌抗原與陽(yáng)性血清抗體孔間形成一條沉淀線，說(shuō)明鴨疫里默氏桿菌抗原與相對(duì)應(yīng)的血清抗體可以發(fā)生特異性結(jié)合，表明鴨疫里默氏桿菌對(duì)應(yīng)的血清型為陽(yáng)性血清的血清型。徐州及周邊地區(qū)鴨疫里默氏桿菌血清型比例見表2。

鴨疫里默氏桿菌主要血清型為Ⅱ型和Ⅰ型，Ⅶ型僅1例，占9.09 %，防治重點(diǎn)在Ⅱ型和Ⅰ型血清型，與之不同的是Ⅶ型發(fā)病不多，混合感染會(huì)造成較大的傷亡，應(yīng)引起重視。

2.3.2 大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果與分析 利用玻板凝集試驗(yàn)，測(cè)定血清型，結(jié)果顯示：大腸桿菌的血清型較為復(fù)雜，凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，O78僅有一例，其余血清型分別為O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，此外一例檢測(cè)結(jié)果為多凝集，無(wú)法準(zhǔn)確判定。分離到的19 種血清型全不相同，給免疫帶來(lái)極大的困擾。

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)徐州地區(qū)鴨疫里默氏桿菌主要血清型為Ⅱ型，占63.64 %;其次為Ⅰ型，占27.27 %;Ⅶ型僅一例，占9.09 %，與往年調(diào)查趨勢(shì)大致相同[4]，亦與我國(guó)主流血清型相同[5]。大腸桿菌的血清型較為復(fù)雜，很多報(bào)道都認(rèn)為O78為優(yōu)勢(shì)血清型[6]，凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，O78血清型并不是本地優(yōu)勢(shì)血清型，分離到的19 種血清型全不相同，給免疫帶來(lái)極大的困擾。

漿膜炎的防治應(yīng)該從管理措施、免疫防治和藥物治療三個(gè)方面著手[7]。在臨床病例描述中，發(fā)現(xiàn)鴨群飼養(yǎng)密度和衛(wèi)生條件與漿膜炎的發(fā)生密切相關(guān)，因而保持合適的飼養(yǎng)密度和改善鴨場(chǎng)衛(wèi)生條件對(duì)漿膜炎的預(yù)防至關(guān)重要。接種疫苗可以有效預(yù)防漿膜炎的發(fā)生，對(duì)于鴨疫里默氏桿菌，徐州地區(qū)的養(yǎng)殖戶可以選擇Ⅱ型和Ⅰ型疫苗進(jìn)行接種，大腸桿菌血清型復(fù)雜，應(yīng)該嘗試新型疫苗，例如轉(zhuǎn)基因疫苗等，能夠抵抗不同血清型的侵?jǐn)_。鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌耐藥性增加，在臨床治療中，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥，不能長(zhǎng)時(shí)間使用同一種藥物，也可選擇中藥進(jìn)行預(yù)防治療。

4 結(jié)論

大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌是引起漿膜炎的主要原因，江蘇徐州地區(qū)2019年度，鴨疫里默氏桿菌主要流行的血清型為Ⅱ型和Ⅰ型，偶見Ⅶ型，而分離到的19種大腸桿菌的血清型分別為O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O78、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，各不相同。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 唐彩琰，Sara Perez.鴨疫里默氏桿菌感染的全球重要性[J].國(guó)外畜牧學(xué)（豬與禽），2017，37（10）：21-22.

[2] 沈貴榮，楊月萍.鴨傳染性漿膜炎流行特點(diǎn)及防控措施[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2019（19）：107-108.

[3] 覃春倫.藥物防治鴨病講究多[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2015，36（07）：43-44.

[4] 王書峰.鴨傳染性漿膜炎的流行病學(xué)、鑒別及防治措施[J].現(xiàn)代畜牧科技，2019（11）：112-113.

[5] 錢學(xué)智.徐州地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2011，7（11）：126-129.

[6] 吳彩艷，程淑琴，張建峰，等.我國(guó)鴨疫里氏桿菌病流行概述[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，38（06）：86-90.

[7] 蘇敬良，黃瑜，胡薛英.鴨病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2016，12：243，268.