磷脅迫下外源乙烯對(duì)杉木幼苗生長(zhǎng)及磷素利用的影響*

陳 敏 賴華燕 鄭姍姍 李 明 馬祥慶 吳鵬飛

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 國(guó)家林業(yè)和草原局杉木工程技術(shù)研究中心 福州 350002)

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與了核酸、磷脂、ATP等重要分子的生物合成，還可通過磷酰基轉(zhuǎn)移和蛋白質(zhì)活化成為調(diào)節(jié)代謝的信號(hào)分子(Zhuetal.,2016)。然而，土壤中的有效磷移動(dòng)性差，極易被鈣、鐵、鋁以及土壤黏粒固結(jié)，難以被植物根系直接吸收利用(Wuetal.,2013)。杉木(Cunninghamialanceolata)是優(yōu)良速生用材樹種，其廣泛分布的南方林區(qū)紅壤有效磷含量低，加上傳統(tǒng)多代連栽的栽培模式，導(dǎo)致林地土壤中有效磷供應(yīng)不足，極大限制了杉木人工林長(zhǎng)期生產(chǎn)力(Farooqetal.,2019)。近年來，有學(xué)者從不同杉木基因型自身高效利用土壤磷能力的差異性出發(fā)，研究篩選出了多個(gè)磷素利用效率較高的杉木基因型(梁霞等，2004；吳文景等，2019)，且這些優(yōu)良無性系可通過改變根系構(gòu)型(Wuetal.,2017；鄒顯花等，2016)、分泌有機(jī)酸(Zouetal.,2018；Yuetal.,2017)等途徑增加對(duì)土壤有限磷資源的吸收機(jī)會(huì)和效率；或者通過根系皮層組織溶解(Wuetal.,2018)、加速體內(nèi)磷素循環(huán)(陳思同等，2018)等途徑提高對(duì)體內(nèi)貯存有限磷素資源的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用效率，最終達(dá)到抵抗磷脅迫的目的。

化學(xué)信號(hào)物質(zhì)也是植物個(gè)體抵抗?fàn)I養(yǎng)脅迫的一種現(xiàn)象(吳鵬飛等，2006)。Lai等(2018)發(fā)現(xiàn)不同杉木基因型根系釋放有機(jī)化合物的種類和含量存在較大差異，其中在低磷脅迫條件下，杉木根系乙烯的釋放量明顯增加，根系乙烯的釋放量與杉木體內(nèi)的磷素積累量呈顯著正相關(guān)。因此，乙烯作為信號(hào)分子在植物的生命活動(dòng)中有著至關(guān)重要的作用(林英超等，2010；Caoetal.,2009)。在植物受到機(jī)械損傷或植食性昆蟲攻擊時(shí)，植物通過乙烯途徑產(chǎn)生的揮發(fā)性信號(hào)物質(zhì)不僅能夠誘導(dǎo)相關(guān)抗病蛋白基因的表達(dá)，還可以產(chǎn)生一些驅(qū)避性或拒食性物質(zhì)，從而提高植物防御的能力(Arimuraetal.，2008；阮維斌等，2010)。

目前，對(duì)杉木根系在磷營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境乙烯含量物質(zhì)的作用還不清楚。鑒于此，本研究選取25號(hào)杉木半同胞家系幼苗為參試材料，采用室內(nèi)沙培控磷試驗(yàn)，模擬外源乙烯對(duì)磷脅迫環(huán)境杉木根系生長(zhǎng)及磷素利用效率的影響。在供磷和不供磷2個(gè)供磷水平處理?xiàng)l件下，分別設(shè)置3個(gè)外源乙烯處理(添加乙烯利、添加乙烯合成抑制劑、添加清水的對(duì)照處理)，測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下杉木苗高、地徑、根系生長(zhǎng)指標(biāo)、磷含量以及根系皮層細(xì)胞溶解率差異性變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，結(jié)合根系乙烯含量與各指標(biāo)的相關(guān)性關(guān)系，探討外源乙烯與磷脅迫因子對(duì)乙烯生物合成以及對(duì)杉木苗木生長(zhǎng)的影響，揭示苗木根系乙烯生成規(guī)律和杉木苗木在逆境下作出的適應(yīng)機(jī)制，為我國(guó)南方紅壤林區(qū)杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取福建漳平五一國(guó)有林場(chǎng)培育的6個(gè)月生1.5代的25號(hào)半同胞杉木家系幼苗為研究對(duì)象，該杉木家系具有較強(qiáng)的根系覓磷能力(Wuetal.,2018)。參試幼苗長(zhǎng)勢(shì)均一，無病蟲害，平均苗高和地徑分別(3.20±0.32)cm和(0.86±0.07)cm。盆栽裝置長(zhǎng)寬各15 cm、高20 cm，為亞克力制材；盆栽基質(zhì)為洗凈河砂[全磷含量(0.11±0.004)mg·kg-1，有效磷為痕量]。每盆栽植1株，位于盆栽裝置中心，于福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院溫室內(nèi)培養(yǎng)，室內(nèi)溫度為18～28 ℃，濕度為75%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)2個(gè)供磷水平：不供磷(P0：0 mmol·L-1KH2PO4)和正常供磷(P1：1 mmol·L-1KH2PO4)。通過補(bǔ)充KCl溶液來保證不同處理間K+的含量一致，其他養(yǎng)分根據(jù)改良的不含磷素的Hoagland不完全營(yíng)養(yǎng)液配方進(jìn)行補(bǔ)充(Wuetal.,2011a;2011b)。在不同供磷水平下設(shè)計(jì)3個(gè)外源乙烯相關(guān)處理(E+：添加200 mg·L-1乙烯利，上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)；0：清水；E-：添加5 μmol·L-1乙烯合成抑制劑CoCl2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。每個(gè)處理重復(fù)4株，總共24株幼苗。

2017年4月20 號(hào)，把乙烯利或CoCl2試劑溶入上述Hoagland不完全營(yíng)養(yǎng)液之后，分別均勻澆施在參試苗木根基四周，每3天澆1次，每次400 mL。處理30天后(2017年5月20日)測(cè)定參試幼苗根系組織內(nèi)乙烯含量，苗高、地徑、根系形態(tài)指標(biāo)、磷素積累和根系皮層細(xì)胞溶解率等指標(biāo)的變化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根系組織內(nèi)源乙烯的收集與含量測(cè)定 采用頂空-氣相色譜法對(duì)不同處理?xiàng)l件下杉木苗木根系組織內(nèi)乙烯進(jìn)行收集。參試杉木幼苗收獲后蒸餾水洗凈根尖，并用濾紙輕拭，剪下根部后分別稱取0.20 g，然后裝入10 mL青霉素瓶中，滴入兩滴蒸餾水，減少傷害乙烯對(duì)試驗(yàn)的干擾，30 min后加蓋密封，常溫遮光放置2 h后抽取2 mL瓶?jī)?nèi)氣體，采用安捷倫QP7890B氣相色譜儀進(jìn)行乙烯含量測(cè)定。測(cè)定條件：19091Z-216(60 m×0.32 mm×1 mm)色譜柱；FID檢測(cè)器；氦氣的載氣壓力6 kPa，流速4 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度200 ℃，不分流；輔助加熱器280 ℃；升溫程序?yàn)?0 ℃(保持3 min)→(5 ℃·min-1)→120 ℃(保持0 min)→(10 ℃·min-1)→250 ℃(保持7 min)；掃描3 min；EI源70 eV；源溫230 ℃；掃描范圍：35～350 amu；掃速：3.125 u·s-1；通過NIST 14質(zhì)譜庫進(jìn)行化合物鑒定。利用純度為99.999%的乙烯標(biāo)樣(佛山科的公司購買)10 mL，繪制乙烯標(biāo)樣濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 根系生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 栽植前和收獲后幼苗根系經(jīng)加拿大數(shù)字化掃描儀(STD1600 Epson USA)進(jìn)行掃描后，采用WinRHizo(version4.0B)根系分析系統(tǒng)軟件對(duì)根系的總根長(zhǎng)、表面積、總體積和直徑增量進(jìn)行定量分析。各根系生長(zhǎng)指標(biāo)均用增量表示，即收獲時(shí)與栽植前測(cè)定值的差值。

1.3.3 磷素含量測(cè)定 將參試幼苗根系和地上部分分別108 ℃殺青，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎、過0.2 mm孔徑篩，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 1.1-1993)中的H2SO4-HClO4消煮法消化植物粉碎樣，用ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer)[珀金埃爾默儀器(上海)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)Optima 8000]測(cè)定P含量(g·kg-1)。

1.3.4 皮層細(xì)胞溶解率測(cè)定 參試杉木苗木收獲后，隨機(jī)選擇完整健康根系5條，用蒸餾水將其洗凈，用小刀截取根尖4～5 mm，放入裝有2.5%戊二醛的1.5 mL離心管中，4 ℃冰箱保存。經(jīng)0.1 mol· L-1的磷酸緩沖液清洗后，鋨酸后固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon樹脂浸透杉木苗木根系；最后在60 ℃烘箱中聚合待測(cè)。

將材料置于超薄切片機(jī)(Leica UC6)上進(jìn)行切片，半薄切片厚度1 μm，切片在載玻片并置于70 ℃恒溫電熱板(Leica EMMP)上展片和干燥，將半薄切片用甲苯胺藍(lán)染液染色，置于光學(xué)顯微鏡下(Olympus BX51)觀察，用附帶的成像系統(tǒng)(Nikon Digital Sight DS-L1)拍照，放大100倍，觀測(cè)皮層細(xì)胞溶解情況，溶解率計(jì)算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 19.0進(jìn)行供磷水平(P0、P1)、外源添加劑處理(E+、0、E-)對(duì)杉木參試幼苗苗高、地徑、根系形態(tài)學(xué)指標(biāo)、養(yǎng)分含量的雙因素方差分析。若2個(gè)因素間無顯著交互作用(P>0.05)，則進(jìn)行單因素方差分析，利用Tukey-b多重比較方法進(jìn)行顯著性比較(Q=0.05)。其中苗高、地徑和根系形態(tài)學(xué)指標(biāo)為試驗(yàn)期間的增量，即收獲時(shí)測(cè)定的數(shù)值與盆栽前的差值，以表征不同處理?xiàng)l件下，參試幼苗各生長(zhǎng)指標(biāo)之間的差異性。

文中所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，相關(guān)圖表均用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脅迫下外源乙烯對(duì)杉木苗木生長(zhǎng)及根系形態(tài)的影響

由表1可知，供磷水平和外源添加劑處理對(duì)苗高、地徑及根系形態(tài)指標(biāo)增量的交互作用達(dá)顯著水平(P<0.05)。從單個(gè)因素看，供磷水平和外源添加劑處理均對(duì)根系生長(zhǎng)各指標(biāo)的影響達(dá)到極顯著水平。

表1 供磷和外源乙烯處理對(duì)杉木苗木形態(tài)生長(zhǎng)影響的雙因素方差分析①Tab.1 Two-way ANOVA of the effects of P supply level and ethylene treatment on the morphological growth of Chinese fir seedlings

與供磷處理(P1)相比，磷脅迫下(P0)添加乙烯處理(E+)和添加乙烯抑制劑處理(E-)下杉木苗高均保持較高增量，兩者差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)，但清水對(duì)照處理下，苗高生長(zhǎng)明顯受到抑制(P<0.05)(圖1A)。從地徑的增量來分析，清水對(duì)照和(E-)理?xiàng)l件下，磷脅迫下地徑的生長(zhǎng)量明顯增多(圖1B)。

不同處理?xiàng)l件下根系各形態(tài)指標(biāo)的變化規(guī)律也存在較大差異。與P1處理相比，P0的E+處理下，根長(zhǎng)增量無明顯變化，而E-處理和清水對(duì)照處理均明顯促進(jìn)了根長(zhǎng)(圖1C)、根表面積(圖1D)的生長(zhǎng)。對(duì)于根系平均直徑而言，P0與清水對(duì)照處理對(duì)其均有明顯的促進(jìn)作用(圖1E)。另外，P1的E+處理下，根系體積增量明顯高于其他處理(圖1F)。

圖1 供磷和外源乙烯處理對(duì)杉木苗木形態(tài)生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of P supply and exogenous ethylene on root growth of Chinese fir seedlingsPo:低磷Low phosphorous;P1:正常供磷Normal phosphorus;E+:添加乙烯劑處理Treatment with ethylene addition;CK:對(duì)照(清水)Control(clear water);E-:添加乙烯合成抑制劑處理Treatment with ethylene synthesis inhibitor added.下同。The same below.

2.2 磷脅迫下外源乙烯對(duì)杉木苗木磷素利用及根系皮層組織溶解的影響

由表2可知，供磷水平和外源添加劑處理對(duì)杉木苗木根系磷含量的交互作用未達(dá)顯著水平(P>0.05)，但對(duì)地上部磷含量的交互作用達(dá)顯著水平(P<0.05)。從單一因素看，外源添加劑處理和供磷水平均對(duì)杉木苗木根系和地上部磷含量的影響均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。對(duì)于根系皮層溶解率而言，2個(gè)因素對(duì)其存在顯著的交互作用(P<0.05)，而且單個(gè)因素對(duì)其影響也均達(dá)顯著水平。

表2 供磷和外源乙烯處理對(duì)杉木苗木磷素含量和根系皮層溶解率影響的雙因素方差分析Tab.2 Two-way ANOVA of phosphorus supply and exogenous ethylene on phosphorus content and root cortex of Chinese fir seedlings

在P0條件下，E+的杉木幼苗地上部磷含量明顯高于清水對(duì)照處理，其他處理之間差異未達(dá)顯著水平(圖2A)。對(duì)于地下根系磷含量，不同處理之間的差異同樣未達(dá)顯著水平(P>0.05)(圖2B)。這可能與磷脅迫條件下，這類杉木家系幼苗體內(nèi)磷素循環(huán)速度較高有關(guān)(陳思同等，2018；Wuetal.,2018)。

圖2 供磷和外源乙烯處理對(duì)杉木苗木磷素含量的影響Fig.2 Effects of P supply and exogenous ethylene treatment on P content of Chinese fir seedlings

由圖3可知，與P1相比，P0條件下E+與清水對(duì)照處理中杉木苗木根系皮層溶解率均明顯較高。同樣在P0環(huán)境，E+處理的杉木苗木根系皮層溶解率顯著高于E-與清水對(duì)照處理(P<0.05)，結(jié)合圖4進(jìn)一步可以判定E+處理可促進(jìn)根系皮層組織細(xì)胞的溶解，而且磷脅迫下，添加外源乙烯處理可以顯著增加根系皮層組織的溶解率。

圖3 供磷和外源乙烯處理對(duì)杉木苗木根系皮層細(xì)胞溶解率的影響Fig.3 Effects of P supply and exogenous ethylene on the of root cortex cells dissolution rate of Chinese fir seedlings

圖4 杉木苗木根系皮層細(xì)胞溶解面積Fig.4 Soluble area of root cortex cells of Chinese fir seedlings

2.3 磷脅迫下外源乙烯對(duì)杉木苗木根系合成乙烯含量的影響

供磷水平和外源添加劑處理兩者對(duì)杉木苗木根系乙烯含量的影響存在顯著的交互作用(F=42.947，P<0.01)。從單個(gè)因素來看，外源添加劑處理分別對(duì)杉木苗木根系乙烯含量的影響也達(dá)顯著水平(P=0.035)。從圖5可知，在P0和P1條件下，E+的杉木苗木根系乙烯含量均明顯高于E-處理(P<0.05)。從清水對(duì)照處理可知，與P1環(huán)境相比較，P0明顯促進(jìn)了杉木根系組織內(nèi)乙烯含量的增加，但條件下E+和E-處理對(duì)其影響均不顯著。

圖5 外源乙烯對(duì)低磷脅迫下杉木苗木根系乙烯含量的影響Fig.5 Effects of phosphorus and exogenous ethylene on the content of ethylene in the root system of Chinese fir seedlings

3 討論

磷是植物生長(zhǎng)的重要元素之一，在土壤中磷素缺乏的情況下，植物會(huì)改變體內(nèi)器官的磷素含量分配以維持植物的正常生長(zhǎng)(Gongetal.,2011)。根系是植物與土壤之間的橋梁，根系接觸到的土壤面積越大，對(duì)土壤中的有效磷吸收的越多，因此，植物根構(gòu)型對(duì)磷吸收具有重要作用(嚴(yán)小龍等，2000)。植物在低磷脅迫條件下，通過改變根構(gòu)型來增加對(duì)土壤中磷素的吸收效率，如低磷條件下促進(jìn)了桉樹(Eucalyptussp.)(翁彩鳳等，2014)、馬尾松(Pinusmassoniana)(楊青等，2011)、木荷(Schimasuperba)(張蕊等，2015)等樹種根系生長(zhǎng)。有研究表明，為改善土壤資源與植物生長(zhǎng)消耗之間的平衡，抑制根系次生生長(zhǎng)，減少磷脅迫下土壤覓食的代謝成本也是一種適應(yīng)性策略(Lynch，2011)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在磷脅迫下添加外源乙烯處理的苗高增量低于正常供磷以及其他處理，而地莖增量則相反，說明乙烯會(huì)抑制莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)莖的橫向增粗，進(jìn)而促進(jìn)了根系的次生生長(zhǎng)，同時(shí)磷脅迫條件下根中皮質(zhì)組織的延遲發(fā)育和通過保持定植與皮質(zhì)的叢枝菌根關(guān)聯(lián)對(duì)磷攝取具有協(xié)同效應(yīng)，其關(guān)系表明二次生長(zhǎng)抑制了叢枝菌根，雖然減少次生生長(zhǎng)有利于菌根共生，但它也會(huì)增加根系對(duì)土壤病原體和食草動(dòng)物的脆弱性(Emmettetal.,2014)。此外，乙烯是通過延緩DELLA蛋白的降解來抑制植物主根生長(zhǎng)的，低磷脅迫下乙烯的增加促進(jìn)了根系莖導(dǎo)管的增粗，從而增加了根系對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，符合乙烯典型的“三重效應(yīng)”(Achardetal，2000；劉厚誠等，2006)。

外源乙烯通過乙烯的自我催化能有效誘導(dǎo)植物生物合成更多的內(nèi)源乙烯(胡花麗等，2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同的供磷水平條件下，添加外源乙烯處理的杉木幼苗根系乙烯含量顯著高于不添加試劑處理的，乙烯含量與根長(zhǎng)和根平均直徑呈正相關(guān)關(guān)系，而根長(zhǎng)增量和根平均直徑增量與磷的吸收量成正比，因此添加外源乙烯增加了杉木幼苗對(duì)磷素的吸收效率。同時(shí)，在磷脅迫下添加外源乙烯的磷素含量明顯高于不添加試劑處理，這可能是因?yàn)橐蚁┩ㄟ^增加根組織對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性來促進(jìn)根系的生長(zhǎng)(王金祥等，2005)，同時(shí)增強(qiáng)的乙烯敏感性會(huì)影響磷缺乏基因的表達(dá)(Leietal.,2011)以及在磷脅迫下根系為適應(yīng)逆境所作出的調(diào)節(jié)機(jī)制，如根系分泌物的釋放、有機(jī)酸的釋放以活化磷分。

另一方面，在磷脅迫下，添加外源乙烯還會(huì)增加杉木幼苗根系皮層細(xì)胞溶解率，這可能是因?yàn)樵诹酌{迫下為減緩根系呼吸會(huì)形成大量的通氣組織(Saengwilaietal.,2014)，而乙烯一直被認(rèn)為是參與多種植物通氣組織形成的信號(hào)分子(Gladishetal.,2008)，在水淹環(huán)境下植物體內(nèi)會(huì)生物合成大量乙烯(陳婷等，2007)，從而促進(jìn)植物體內(nèi)皮層細(xì)胞溶解，致使大量通氣組織的形成，并加快了植物體內(nèi)磷素循環(huán)速率(Wuetal.,2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，磷脅迫下外源乙烯對(duì)杉木幼苗的形態(tài)生長(zhǎng)有影響，但引起杉木幼苗根系形態(tài)變化是根系乙烯增加還是植株體內(nèi)分配格局調(diào)整還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

磷脅迫外源乙烯處理下杉木幼苗根系乙烯含量與根系形態(tài)生長(zhǎng)有顯著相關(guān)關(guān)系。在不同供磷水平下，添加外源乙烯處理抑制了杉木幼苗苗高的生長(zhǎng)，促進(jìn)了杉木幼苗地徑的生長(zhǎng)；磷脅迫下添加外源乙烯處理促進(jìn)了杉木幼苗根長(zhǎng)、根平均直徑、根體積增長(zhǎng)，正常供磷條件下添加外源乙烯處理促進(jìn)了杉木幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積增長(zhǎng)；在不同供磷水平下，添加外源乙烯處理增加了地下磷含量。添加外源乙烯處理增加了幼苗根系乙烯的含量，且磷脅迫下不添加乙烯處理的根系乙烯含量高于正常供磷，根系皮層細(xì)胞溶解率提高，磷素循環(huán)利用率加快。綜上所述，添加外源乙烯會(huì)誘導(dǎo)杉木幼苗增加內(nèi)源乙烯的合成與釋放，從而增加了根系各形態(tài)指標(biāo)的增長(zhǎng)，提高根系覓磷能力和對(duì)體內(nèi)磷素的利用效率，以有利于抵抗低磷脅迫環(huán)境，促進(jìn)杉木幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。