高效液相色譜-串聯質譜法同時測定豬肉中30種β-受體激動劑

馮騰壘，曹彥衛，張夢雪，李 云，郭琳琳，楊 健，宋 瑞

（1. 石家莊畜產品和獸藥飼料質量檢測中心 050041; 2. 河北省林草花卉質量檢驗檢測中心 050081;3. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司 100015; 4. 石家莊市農業行政綜合執法支隊 050000）

β-受體激動劑是一種母核為苯乙醇胺結構的物質，按照苯環上取代基的不同，可分為苯胺型和苯酚型，而苯酚型β-受體激動劑有分為鄰苯二酚型、間苯二酚型及水楊醇型，其結構式如下圖所示。

圖1 β-受體激動劑分子結構式

β-受體激動劑屬于苯乙醇胺類藥物，在醫學上其可用于治療支氣管疾病和肺炎，但在動物試驗中發現，當用藥量超過規定劑量的5～10倍時，會在生物體內產生“再分配現象”。其結果使動物體內營養組分由脂肪轉向至肌肉組織，增加了脂肪的分解代謝、使體內蛋白質合成增多，使用藥個體體重增加，因此被一些養殖戶非法用于畜牧飼養，導致動物源性食品中β-受體激動劑嚴重超標。人體長期食用含有β-受體激動劑的食品，將對其健康產生傷害，可致使用者發生肌肉震顫、心律不齊、暈眩等不良反應，尤其對于孕婦、體質虛弱者等，副作用更大，因此各國嚴禁將β-受體激動劑用于動物養殖中。

目前，檢測動物源性食品中β-受體激動劑的方法有氣相色譜-串聯質譜法，高效液相色譜法，免疫親和色譜法，液相色譜-質譜聯用法等。由于該類化合物種類多，性質相差較大，以往檢測方法靈敏度較低、適用范圍少、操作流程復雜等缺點，難以同時檢測多種β-受體激動劑。因此，需要建立快速測定動物源性食品中的多種β-受體激動劑的液相色譜串聯質譜方法。

針對現有方法靈敏度低、同時檢測化合物種類少等缺點，基于SCIEX Triple QuadTM 5500系統，建立了快速檢測豬肉中的30種β-受體激動劑的方法，該方法檢測化合物具有種類全、靈敏度高、回收率好、分析速度快好等特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Sciex 5500高效液相色譜-串聯質譜儀(美國SCIEX公司)、MS3 digital渦旋混合器(德國IKA公司)、渦旋混勻儀(德國heidolph公司)、ROTINA 380R冷凍離心機(德國Hettich公司)、氮吹濃縮儀(美國Horizon technology公司)、S210型pH計(美國梅特勒公司)、PPM48正壓固相萃取儀(美國J2 Scientific公司)。

β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶(上海安譜實驗科技有限公司)，甲醇、甲酸均為色譜純，購自天津阿爾塔科技有限公司，乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司，固相萃取柱為Agela Cleanert MCX。

氯丙那林、西馬特羅、特布他林、妥布特羅、塞布特羅、沙丁胺醇、齊帕特羅、克侖丙羅、克倫特羅、利托君、噴布特羅、萊克多巴胺、馬布特羅、克侖賽羅、馬噴特羅、拉貝洛爾、苯乙醇胺A、苯氧丙酚胺、溴布特羅、班布特羅、沙美特羅、3-甲氧酪胺、福莫特羅、非諾特羅、溴氯布特羅、克侖潘特、多巴胺、奧西那林、異克侖潘特、丙卡特羅，均為天津阿爾塔科技有限公司標準液，濃度為100mg/L。

1.2 標準溶液配制

混合標準中間液：將30種β-受體激動劑標準液用甲醇稀釋成濃度為1mg/L的混合標準中間儲備液，保存在棕色瓶中-20℃。

混合標準工作溶液：使用前，用乙腈-1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液將中間儲備液稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

2 實驗方法

2.1 樣品前處理

準確稱量2.0g豬肉試樣置于50mL離心管內，加入0.2mol/L乙酸銨溶液（pH=5.2）8mL，再加入40μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，在37℃避光水浴條件下振蕩16h。

酶解完成后，靜置至室溫，10000r/min高速離心10min，將上清液倒入另一50mL離心管中，加入5mL 0.1mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻后，接著用高氯酸調pH至1.0±0.2，10000r/min離心10min后，將上清液倒入另一50mL離心管內。用飽和NaOH溶液調pH至9.5±0.2，加入15mL乙酸乙酯，渦旋混合后，振蕩10min，5000r/min離心5min，將有機相倒入另一50mL離心管內。再在下層水相中加入叔丁基甲醚10mL，渦旋混勻，并振蕩10min，5000r/min離心5min，合并有機相，50℃下氮氣吹干，用2%甲酸溶液5mL溶解，備用。

分別用3mL甲醇、3mL水、3mL 2%甲酸溶液活化固相萃取柱，將上述備用液過柱，隨后用2%甲酸溶液、甲醇各3mL淋洗固相萃取柱，吹干，用2.5mL 3%氨水甲醇溶液洗脫；將洗脫液在50℃下用氮氣吹干。用0.2mL甲醇-0.1%甲酸溶液溶解殘留物，渦旋混勻，15000r/min高速離心10min，取適量上清液，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2.2 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex F5，2.6μm，3.0mm×100mm

流動相：A：水（1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸）

B：乙腈

流速：0.6mL/min

進樣量：5μL

梯度洗脫程序：如表1所示

表1 液相梯度設置

2.3 質譜條件

掃描方式：MRM采集模式，正離子掃描

離子源：ESI源

離子源參數：

IS電壓：5500 V

源溫度 TEM：600℃

氣簾氣 CUR: 30 psi 碰撞氣 CAD: Medium

霧化氣 GS1: 55 psi 輔助氣 GS2: 60 psi

3 結果與討論

3.1 流動相條件選擇

分別用乙腈-水溶液、乙腈-0.01%甲酸水溶液和乙腈-（1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸）水溶液3種體系作為流動相，比較在相同洗脫模式下化合物的響應和出峰情況。結果表明，流動相體系中加入適量的甲酸，可提高化合物的靈敏度，而作為緩沖鹽甲酸銨的加入，則可改善化合物峰形的拖尾，尤其對出峰比較靠前的3-甲氧酪胺和奧西那林，峰形有明顯改善。因此，最終選定流動相體系為乙腈-（1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸）水溶液。

3.2 質譜條件選擇

利用針泵直接進樣的方式，將30種β-受體激動劑的標準溶液(50ng/mL)以7μL/min的流速直接注入Triple QuadTM 5500質譜儀中，在電噴霧電離正離子模式(ESI+)下，對目標物進行Q1 MS全掃描，得到母離子信息，接著母離子進行(MS2)二級掃描，得到定性和定量子離子信息，然后在多反應監測模式(MRM)下，對相應離子對的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓的參數進行優化。

3.3 30種β-受體激動劑的總離子流圖

取混合標準工作溶液，在該色譜-質譜條件下進行測定，得到的總離子流圖如圖2所示，30種β-受體激動劑均實現了很好的分離，分離度好且保證了良好的峰形。

圖2 30種β-受體激動劑的總離子流圖

3.4 實際樣本前處理回收率和重復性

稱取不含待測物組分的試樣各2.0g，分別添加三個不同濃度，在每個濃度中做6個平行樣。混合均勻后，依據前處理方法處理樣品，并在此實驗條件下測定。結果表明，不同濃度的基質回收率為78%～109%，相對標準偏差RSD為1.3%～4.6%，這表明此方法的回收率高，通用性好，可以用來檢測不同動物源性食品中的30種β-受體激動劑。

4 實際樣本的檢測

采用該方法，測試石家莊超市中購買的豬肉和雞肉產品中的30種β-受體激動劑的含量，結果均為未檢出。

5 總結

本研究利用 液相色譜-質譜系統，建立了可以同時測定豬肉中的30種β-受體激動劑的檢測方法；一針進樣，9min完成了30種β-受體激動劑準確定性和定量的測定；本實驗驗證了實際樣品在三個濃度范圍的添加回收率，結果均在78%～109%，相對標準偏差為1.3%～4.6%。經過檢測實際樣本，未檢出β-受體激動劑。該方法快速、準確、全面的完成了豬肉中的30種β-受體激動劑的測定。