鄭州地區草莓紅斑葉枯病病原鑒定及防治藥劑篩選

李忠峰 王 磊 劉金文 張趁玲

（1.中牟縣廣惠街街道辦事處 河南中牟451450；2.中牟縣農業技術推廣站 河南中牟451450；3.中牟縣原種場 河南中牟451450）

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬，為多年生草本園藝作物，具有適性廣、果期長、產量高、效益好等特點，是鄭州地區冬季時令水果。近年來，隨著都市型現代農業的迅猛發展，全國草莓種植面積已達11.997萬hm2，年產量306.03萬t，穩居世界首位[1]。但是受連作障礙、不合理施肥和農藥等諸多因素的影響，草莓紅斑葉枯病的發生日益頻繁，呈逐年加重發生趨勢，成為制約我國草莓產業發展的重要障礙。

草莓紅斑葉枯病是鄭州地區草莓生產上發現的一種新病害。該病最早于2017年9月在鄭州市中牟縣西春崗村由春峰草莓種植合作社理事長李峰首次發現，初發期他認為是草莓缺素所致，采取補磷措施后仍不見好轉，且死棵現象十分嚴重，給當地莓農造成了很大的經濟損失。自2018年以來，該病連續2年在鄭州地區大面積發生，嚴重挫傷了草莓種植戶的種植積極性。經過連續2年的田間觀察，草莓紅斑葉枯病以‘甜查理’品種受害最為嚴重，而紅顏、章姬、寧玉等品種則較輕。同時，該病常與草莓根腐病、炭疽病等混合發生，發生早、蔓延快、難控制，輕者死苗8.3%～13.7%，重者死苗率在50%以上，甚至整棚毀種，給廣大莓農造成了極大的經濟損失。

目前國內外對草莓出現紅葉枯死的研究報道很多，且說法不一。多數學者研究認為，草莓葉片發紅枯死是由草莓根腐病菌引起的[2-6]；張海英等[7]、林祥文等[8]、王 步云 等[9]、姚紅燕等[10]、任海英等[11]研究認為，草莓炭疽病也能引起草莓葉片發紅枯死，其優勢種為膠孢炭疽菌 （Colletotrechum gloeosporioides）、草莓炭疽菌 （Colletotrechum fragariae）、尖孢炭疽菌（Colletotrechum acutatum）等；還有一部分學者研究認為，擬盤多毛孢也是草莓紅葉枯死的主要致病菌。如Chamorro等[12]首次報道了由Pestalotiopsis clavispora和Neopestalotiopsis clavispora侵染草莓，可造成草莓根冠變色及棕褐色壞死；寧志怨等[13]研究報道了安徽省草莓紅葉病是由棒狀擬盤多毛孢菌所引起，在國內首次提出了草莓紅葉病；趙景楠[14]等研究認為，棒狀擬盤多毛孢菌主要引起草莓棒孢葉斑病，發病初期草莓葉片上出現紅褐色的病斑，后擴展為不規則形病斑，邊緣呈紅褐色，中央呈灰白色，并逐漸干枯死亡；徐淑華等[15]、張陽等[16]、趙宇等[17]則研究認為，擬盤多毛孢（P.clavispora）引起河北滿城、北京昌平、山東青島等地區草莓出現紅葉枯死，是引起草莓根腐病的致病菌優勢種。而河南對草莓紅葉、萎蔫枯死的病原鑒定研究尚處于空白。為明確河南草莓紅斑葉枯病的病菌種類，本研究采用室內組織分離的方法，進行了形態學和分子生物學鑒定，并通過抑菌圈比較試驗和室內毒力測定法對6種殺菌劑進行室內藥劑篩選，以此指導鄭州地區草莓紅斑葉枯病的防治。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病株來源 草莓病葉標本于2020年9月采自鄭州市中牟縣姚家鎮梁家村和刁家鄉小王莊村發病的草莓田。草莓品種為甜查理，病葉癥狀典型。

1.1.2 供試藥劑 1%申嗪霉素SC（上海農樂生物制品股份有限公司生產）、50%氯溴異氰尿酸WP（河南銀田精細化工有限公司生產）、40%氟硅唑EC（美國杜邦有限責任公司生產)、80%乙蒜素水劑AS（河南科邦化工有限公司生產）、25%吡唑醚菌酯EC（德國巴斯夫公司生產）、10%苯醚甲環唑WG（瑞士先正達公司生產）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法進行分離，先用流水沖洗感染的葉片30 min，從病健交界處剪取5 mm大小的感病組織塊，置入培養皿中，用75%酒精浸泡30 s，再用1%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min，隨后用無菌水漂洗3次，吸干表面水分后接種于PDA平板上，在28℃黑暗條件下培養3 d，挑取菌落轉皿培養并純化，純化菌株編號保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 病原菌形態學觀察 將純化菌株在新鮮的PDA平板上活化4 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊移至PCA平板中央，置28℃黑暗培養，每日觀察病原菌的菌落形態、生長及顏色。培養15 d后，挑取少量菌絲制成水浸玻片，鏡檢病菌的分生孢子和孢子梗形態及產孢情況，并測量其大小。參考真菌分類學特征描述進行形態學鑒定[18]。

1.2.3 病原菌致病性測定 采用室內離體葉片接種法進行回接試驗，通過對健康的草莓葉片進行接種試驗，檢驗是否能發生草莓紅斑葉枯病。首先，將分離菌株轉入新鮮的PDA平板上培養，7 d后在菌落邊緣挑取直徑為5 mm的菌絲塊備用。其次，用純凈水對草莓葉片沖洗30 min，待葉片干燥后，用75%的酒精對葉面進行消毒，然后用無菌水沖洗，并用無菌棉輕輕擦去殘留的水。接種時先用解剖針輕刺3～5次，將準備好的菌絲塊貼于傷口處，然后用蘸過無菌水的棉球覆蓋、固定，用透明塑料袋包好保濕培養24 h后去掉保濕棉和菌絲塊。從第3天起連續觀察發病情況，待回接發病后，再進行分離培養，鑒定病原菌種類，檢測病原菌致病性。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 病原菌ITS序列的測序委托河南農業大學植保學院完成，將測序結果在NCBI上的GenBank數據庫進行序列同源性比對[19-20]，用MEGA 5.2的Neighbor-joining法構建系統發育樹，采用Bootstrap對系統發育樹進行檢驗，共1 000次循環。

1.2.5 抑菌作用測定 采用生長速率法進行室內毒力測定，根據各供試藥劑的田間推薦使用濃度，各設5個不同的濃度梯度，配制成不同濃度的帶藥PDA平板（表1），以每個濃度為1個處理，以不含藥的培養基為對照。在活化培養4 d的菌落邊緣用打孔器打取5 mm大小的菌絲塊，將其接種至不同濃度的帶藥PDA平板上。25℃培養7 d后，測量菌落直徑，取平均值，計算相對抑制率及各殺菌劑的毒力回歸方程y=kx+b，并計算EC50值及相關系數。

表1 各供試藥劑濃度梯度

2 結果與分析

2.1 草莓紅斑葉枯病株田間癥狀觀察

田間受害病株癥狀表現：草莓幼苗定植后初期病癥不明顯，但植株長勢矮化、瘦弱，生長遲緩；初花期開始顯癥，葉片自下而上，在葉片外緣頂部1/3處呈紅褐色或灰褐色不規則斑點狀，僅葉脈保持綠色，后逐漸擴展為橢圓形或不規則形病斑，邊緣呈紅褐色，中央灰白色，病斑周圍褪綠，有黃色暈圈，后期整個葉片呈紅褐色，嚴重時整個葉片焦枯。拔出病株發現草莓根系多呈灰褐色或黑褐色，不發新根，或新發根系少，無根毛或須根，呈黃褐色，剖其根莖基部也未見髓部有異常的變色。該病傳染性極強，低溫、溫度大的條件下，病株附近的草莓苗也很快會表現出類似的癥狀。

2.2 對病原菌的形態學鑒定

經病原菌分離和純化，從具有典型癥狀的病菌組織下獲得一株真菌CM3，該菌株在PDA平板上25℃培養5 d后，在PDA培養基上菌落呈白色濃密狀菌絲體，表面呈波浪狀，背面淡黃色，8 d后菌落表面產生黑色點狀物，并分泌有黑色粘狀物。分生孢子呈紡錘形或梭形，有4個橫隔膜，測量大小為（19.35～32.50）μm×（8.1～9.2）μm。 分生孢子頂端細胞呈透明狀，并長有附屬絲，分生孢子中央深褐色。根據鏡檢病原菌的形態學特征，該病原菌與擬多盤鞭毛菌（Pestalotiopsis clarispora）相似。

2.3 對草莓的致病性測定

采用室內離體葉片接種法，對健康的草莓嫩葉進行回接試驗，接種5 d后，在草莓葉片接種處出現褐色病斑，病斑周圍葉片褪綠，與之前在田間采集的病株葉片上的癥狀基本相似。接種7 d后，病斑腐爛部位產生白色菌絲，后期長出黑色小點。從接種后發病的葉片上可重新分離培養出該病菌，證明CM3是引起草莓紅斑葉枯病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

經河南農業大學植保學院對病原菌CM3的基因組DNA提取，PCR擴增rDNA-ITS片段測序，將測序結果在NCBI上的GenBank數據庫進行序列同源性比對，用MEGA 5.2的Neighbor-joining法構建系統發育樹（附圖），采用Bootstrap對系統發育樹進行檢驗分析，CM3與GQ415344.1、KY962990.1、KY810807.1、KY810809.1、KY962989.1、KM264343.1、GU595048.1屬于同一分枝，同源性達100%，確定菌株CM3為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clarispora）。

附圖 MEGA 5.2對病原菌的ITS和185-rNDA序列的發育樹分析

2.5 室內抑菌試驗

2.5.1 對病原菌菌絲生長的影響 由表2可知，6種藥劑對草莓紅斑葉枯病的菌絲生長均有一定程度的抑制作用，其生長速率隨著藥劑濃度的增加抑制率上升。其中，10%苯醚甲環唑WG抑制效果最好，抑制率達94.91%；1%申嗪霉素SC和50%氯溴異氰尿酸WP次之，抑制率分別為92.11%和91.05%；40%氟硅唑EC和25%吡唑醚菌酯EC抑制效果分別為89.12%、88.07%；對菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑AS，在最高濃度下其抑制率僅為84.91%。

表2 不同藥劑對病原菌菌絲生長的影響

2.5.2 對病原菌的毒力測定 由表3可知，在供試的6種藥劑中，10%苯醚甲環唑對病原菌的毒力最強，其EC50值最小，僅為11.88 mg/L；40%氟硅唑效果次之，其EC50值為33.29 mg/L；1%申嗪霉素和50%氯溴異氰尿酸EC50值分別為47.13 mg/L和68.21 mg/L，25%吡唑醚菌酯EC50值為91.34 mg/L；對菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑，其EC50值高達398.26 mg/L。

表3 不同藥劑對病原菌的毒力測定結果

3 討論與結論

當前我國已經成為草莓第一大生產國，隨著草莓種植面積的日益擴大，連作年限的增長，草莓紅斑葉枯病的防治已成為草莓產業生產中亟待解決的重大問題。本試驗采用rDNA-ITS片段測序分析并結合致病性測定，將鄭州地區草莓紅斑葉枯病的病原菌鑒定為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clarispora）。該結論與寧志怨等[13]的研究結果相一致。同時，在本試驗中致病性測定時，棒狀擬盤多毛孢病原菌，既可以從解剖針輕刺的傷口侵染，也可直接侵染發病，這與趙景楠等[14]的研究發現從草莓上分離的P.clarispora致病性較弱，只可通過傷口侵染，但不能直接侵染的結論有所不同，這說明棒狀擬盤多毛孢致病性在不同地區存在明顯差異。

草莓紅斑葉枯病是設施草莓連作障礙生產中發現的一種新病害。棒狀擬盤多毛孢菌在自然界中廣泛存在，種類繁多，可引起多種植物發病[21-25]，造成嚴重的經濟損失。目前，國內對草莓病害的防治仍采取以藥劑防治為主、其他防治措施為輔的原則。本研究進行了6種殺菌劑對草莓紅斑葉枯病的病原菌抑菌試驗，結果表明，10%苯醚甲環唑WG對病原菌的抑制率最高，達94.91%；其次為1%申嗪霉素SC和50%氯溴異氰尿酸WP，而80%乙蒜素水劑抑制率最差。毒力測定結果表明，10%苯醚甲環唑WG對病原菌的毒力最強，其EC50值最小，僅為11.88 mg/L；其次依次為40%氟硅唑EC、1%申嗪霉素SC、50%氯溴異氰尿酸WP、25%吡唑醚菌酯EC，對菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑AS，其EC50值高達398.26l mg/L。

由于棒狀擬盤多毛孢致病性較強，且草莓紅斑葉枯病在鄭州地區的發生、流行特點和發病規律尚缺乏深入了解，目前對其致病機理尚不清楚，一旦大面積發生將很難控制。同時，本研究的抑菌試驗是在室內進行的，今后有待于在大田生產中加以實踐應用證實。