高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定馬鈴薯中的α-茄堿和α-卡茄堿

◎ 陳琳珊，陳佩佩，陳 茹，吳永坤

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗站，廣東 廣州 511442；4.中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，廣東 中山 528400）

茄堿是一種有害的生物堿類物質(zhì)，主要以糖苷的形式存在，一般出現(xiàn)在茄科類作物中，尤其是腐敗的茄科蔬菜[1]，是導(dǎo)致茄科蔬菜中毒中的常見毒素之一。其主要成分為α-茄堿和α-卡茄堿，結(jié)構(gòu)式見圖1。茄堿抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性，從而使乙酰膽堿積聚，引起神經(jīng)興奮，胃腸肌肉痙攣，中毒時出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心和嘔吐等癥狀，情況嚴重時可導(dǎo)致脫水、發(fā)熱、昏迷，甚至呼吸衰竭[2-3]。盡管有研究表明，茄堿對前列腺、肝、乳腺等癌細胞有一定的抑制作用[4-6]，但對消費者日常飲食的危害也不容忽視。

圖1 α-茄堿和α-卡茄堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖

目前，針對茄堿的分析方法主要分為化學(xué)方法、成像技術(shù)和生物技術(shù)3大類[7]，由于分光光度法[8]、成像技術(shù)[9]、放射免疫[10]、酶聯(lián)免疫[11]和比色法[12]等方法存在定量不準確、操作煩瑣、耗時長和價格昂貴等缺點，科研工作者的研究主要集中在高效液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。但高效液相色譜法需調(diào)節(jié)流動相使目標物有效分離，因此分析時間長，且α-茄堿和α-卡茄堿吸光度較弱，因此檢測波長較低，容易受雜質(zhì)干擾，影響分析結(jié)果。質(zhì)譜法具有定性定量能力強、分析時間短、靈敏度高等優(yōu)點，適合常規(guī)實驗室的批量化檢測。本文建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，經(jīng)方法學(xué)驗證，具有較高靈敏度，同時回收率高，重現(xiàn)性好，可為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

API4000Q TRAP質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）、4k-15離心機（北京卓明貿(mào)易有限公司）、IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）、Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（法國Merck Millipore公司）。

α-茄堿、α-卡茄堿（純度大于98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司，購自上海安譜公司）、甲酸、甲醇、乙腈（LC-MS級，美國Thermo Fisher公司）、C18、PSA、GCB、硅膠、NH2粉、中性氧化鋁、堿性氧化鋁（分析純，購自上海安譜公司）。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液：分別稱取兩種茄堿適量標準品，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg·mL-1的標準溶液，于4 ℃下避光保存。

混合標準工作溶液：將標準溶液用乙腈稀釋為10 mg·L-1的中間液，將馬鈴薯基質(zhì)溶液依次稀釋為10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1、1 000 μg·L-1制作校準曲線，標準加入法定量。

1.3 樣品前處理

馬鈴薯樣品均質(zhì)。稱取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加5 mL 水和20 mL 0.5%甲酸乙腈溶液（V/V），渦旋混勻，加4.0 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉粉末，渦旋提取10 min。后置于離心機中，以10 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，并定容混勻。取1 mL提取液用50 mg C18凈化，過膜上機。

1.4 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流動相A（乙腈）-B（0.1%甲酸水溶液）（V/V）；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min：40%A，0.5～3.0 min：40%～90%A，3.0～3.5 min：90%A，3.5～4.0 min：90%～40%A，4.0～5.0 min：40%A。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源電離方式：正模式；氣簾氣壓力：25 psi；電離電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GAS1）：50 psi；加熱輔助氣（GAS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

α-茄堿和α-卡茄堿均為糖苷，由于其主體結(jié)構(gòu)上含有一個叔胺堿的N原子，在ESI源正負離子模式均有響應(yīng)。經(jīng)兩種模式對相應(yīng)的母離子掃描后發(fā)現(xiàn)，正離子模式下母離子[M+H]+比負離子模式下的[M-H]-的響應(yīng)更強，可能是因為主體結(jié)構(gòu)上的N原子或糖苷上的O原子獲取H原子的能力比糖苷上羥基-OH失去H原子更容易發(fā)生。確定母離子后，通過調(diào)節(jié)碰撞電壓（Collision Energy，CE）獲得盡可能多的二級子離子，以多反應(yīng)監(jiān)測模式分別對去簇電壓（Declustering Potential，DP）及子離子對應(yīng)的碰撞電壓進行優(yōu)化，α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測方法測定α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)表

2.2 色譜柱的選擇

α-茄堿和α-卡茄堿結(jié)構(gòu)十分相似，其差異僅為糖苷位置不同和糖苷上的羥基數(shù)量不同，在化學(xué)式上的差異也僅有一個O原子的質(zhì)量數(shù)，因此其色譜行為也十分相似，在色譜中難以分離，盡管對于三重四極桿結(jié)構(gòu)來說，可不作細致的色譜分離，但由于化學(xué)式相似，為避免α-茄堿在離子源內(nèi)裂解出m/z852.9，影響定量結(jié)果，實驗使用了安捷倫、Waters和菲羅門公司的3款色譜柱，對2種目標物進行分離。如圖2所示，只有Waters公司的Xbridge BEH C18色譜柱有良好分離效果，原因可能是色譜柱的粒徑大小對分離效果有較大影響，因此選擇Xbridge BEH C18色譜柱。

2.3 固相萃取劑種類的選擇

在實驗初期發(fā)現(xiàn)，在乙腈中加入甲酸能提高回收率，但體積在20 mL以上時，回收率變化不大，因此在此基礎(chǔ)上對固相萃取劑種類進行探究。使用量為50 mg時，結(jié)果顯示C18的回收率最高，GCB和堿性氧化鋁對目標物吸附嚴重，回收率極低。盡管PSA和硅膠能吸附糖類或其他大極性雜質(zhì)，但回收率也低于50%，綜合考慮，選擇C18對提取液進行凈化，詳細結(jié)果見圖3。

圖3 固相萃取劑種類對回收率的影響圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣品含有淀粉較多，若使用針對淀粉進行凈化的固相萃取劑，對目標物也有嚴重吸附，因此可能存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。為進一步考察，實驗使用乙腈溶液配制濃度為100 μg·L-1的單點標準溶液，取2份馬鈴薯基質(zhì)液，1份直接測定本底值，1份用于配制基質(zhì)單點，濃度為100 μg·L-1。以乙腈溶液配制的單點計算，扣除本底值后，基質(zhì)單點中α-茄堿和α-卡茄堿的濃度分別為43.5 μg·L-1和48.1 μg·L-1，說明基質(zhì)效應(yīng)抑制響應(yīng)值比例為原來的45%，小于80%，需用基質(zhì)曲線進行校正，由于沒有找到空白的基質(zhì)樣品，因此校正濃度截距后定量。

2.5 定量方程及準確性

使用馬鈴薯基質(zhì)液配制曲線后測定，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，得到的曲線的X軸截距的絕對值為該樣品含量，若要使用此曲線對其他馬鈴薯樣品進行定量，需將X軸截距校正至原點。在1.2的線性范圍內(nèi)（10～1 000 μg·L-1），測定α-茄堿和α-卡茄堿的曲線方程分別為Y=88.5X+3 800和Y=157X+2 970，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6和0.999 4。按照信噪比的3倍和10倍不斷稀釋樣品濃度后，方法檢出限均為0.1 mg·kg-1，定量限均為0.3 mg·kg-1。線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限均滿足一般樣品中α-茄堿和α-卡茄堿含量的測定，達到準確定量。

2.6 方法學(xué)結(jié)果評價

按1.3對樣品進行測定，選擇含量最低的樣品平均測定6次，取其平均含量作為本底值。按照本底值附近的1倍、2倍和5倍3個水平進行加標。每個水平測定6次，α-茄堿和α-卡茄堿的3個添加水平的平均回收率范圍在85.7%～99.5%，相對標準偏差RSD在1.89%～3.31%。回收率及精密度均能達到定量要求，結(jié)果見表2。

表2 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度表（n=6）

3 結(jié)論

建立HPLC-MS/MS法同時測定馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿，使用甲酸-乙腈萃取后，鹽析離心，進一步使用C18固相萃取劑凈化，回收率達85%以上；多反應(yīng)監(jiān)測模式對母離子和子離子進行掃描，優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)，使方法整體檢出限和定量限達到分析定量要求；使用不同色譜柱進行對比，在優(yōu)化的色譜條件下，α-茄堿和α-卡茄堿2 min內(nèi)完全分離，且分離度高；3水平加標回收實驗的回收率和相對標準偏差結(jié)果表明，該方法可作為日常馬鈴薯品質(zhì)監(jiān)控的有效手段。