液相色譜-串聯質譜法檢測蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留

◎ 劉 毅，張居舟

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，將其貯存于蜂巢內的巢脾中，并經充分釀造而成。成熟蜂蜜是一種具有濃郁花香味的天然甜物質，含有葡萄糖、氨基酸、礦物質、果糖、酶類和抗氧化物等，是對人體有益的天然食品[1]。隨著生活水平的提高，人們對蜂蜜的需求量增長迅速，對其品質和質量的要求也越來越高，蜂蜜中獸藥殘留也逐漸得到人們關注。

酰胺醇類曾被稱為氯霉素類抗生素，是抗生素的常用成分，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有很強的殺滅作用，因其廣譜的抗菌性被廣泛應用于獸醫臨床，但該類藥物經食物鏈進入人體后會對人體健康構成威脅[2]。酰胺醇類藥物在蜜蜂養殖過程中曾被廣泛使用，而農業農村部公告第250號已明確指出氯霉素及其鹽、酯禁用于所有食品動物[3]。為保障消費者安全，控制酰胺醇類物質在蜂產品中的使用，有必要建立一種靈敏、高效的酰胺醇類物質殘留檢測技術。

目前，對蜂蜜等蜂產品中的多種酰胺醇類物質（包括琥珀氯霉素，棕櫚氯霉素等）的檢測方法并不多，本文建立了一種基于液相色譜-串聯質譜法[4]檢測蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留的方法。試樣經乙酸乙酯提取濃縮后用水溶解，Oasis HLB固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜儀測定，氯霉素用內標法定量，氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、棕櫚氯霉素用外標法定量[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters TQ-S超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀（美國Waters公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯的標準物質，氯霉素氚代內標（氯霉素-D5），均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，質譜純），德國Merck公司；HLB固相萃取柱：Oasis HLB 6 mL/200 mg，美國Waters公司。其他所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）標準儲備溶液的配制。分別稱取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯標準物質5.0 mg，各自置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成500 μg·mL-1的標準儲備溶液。準確稱取1.0 mg的氯霉素-D5標準物質，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度配成100 μg·mL-1的內標標準儲備溶液。

（2）混合標準溶液中間液的配制。分別準確移取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯標準儲備溶液，用乙腈稀釋成50 μg·mL-1的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯混合標準溶液中間液。

（3）氯霉素氚代內標（氯霉素-D5）標準溶液中間液的配制。準確移取適量的氯霉素-D5標準儲備溶液，用乙腈配成1 μg·mL-1內標中間溶液。

（4）混合標準工作溶液的配制。分別準確移取混合標準溶液中間液及內標中間溶液，用流動相稀釋 成 濃 度 為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

（1）提取。將蜂蜜置于不超過60 ℃的水浴中振蕩，待樣品全部融化后攪拌均勻，冷卻至室溫。稱取5 g試樣，精確到0.01 g，置于50 mL具塞離心管中，加入氯霉素氚代內標（氯霉素-D5）中間溶液和5 mL水，于渦旋混合器上渦旋混合1 min，使試樣完全溶解。加入15 mL乙酸乙酯，在超聲波振蕩儀上超聲振蕩10 min，取出試樣置于離心機中，以6 000 r·min-1離心5 min，準確吸取上層乙酸乙酯于15 mL離心管中，經氮氣吹干，加入5 mL水溶解殘渣，待凈化。

（2）凈化。HLB固相萃取柱分別用5 mL水和5 mL乙腈活化，將待凈化液轉移到固相萃取柱上，棄去流出液，待溶液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL乙腈水溶液淋洗，棄去全部淋出液，抽至近干，用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中，氮氣吹干，用1 mL流動相定容，過0.22 μm有機相濾膜[6]，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 液相色譜和質譜條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：BEH C18柱，2.1×50 mm，粒徑1.7 μm；流動相：A為含0.1%甲醇的水溶液，B為甲醇。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。液相色譜梯度洗脫程序為：0～0.5 min，90%A；0.5～5.0 min，90%A～10%A；5.00～5.01 min，10%A～90%A；5.01～7.00 min，90%A。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應監測；掃描方式：負離子掃描（ESI-）；毛細管電壓：3.00 kV（ESI-）；脫溶劑氣溫度：440 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·h-1；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流速：150 L·h-1。

2 結果與分析

2.1 優化質譜條件

在負離子掃描模式下確定目標化合物的母離子和定性、定量離子對并優化質譜的各參數質譜參數優化結果，見表1。

表1 6種化合物質譜參數表

2.2 線性范圍與檢出限

將5種酰胺醇類藥物標準儲備液分別配制成0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1的溶液進行檢測，各類藥物的檢出限為0.1 μg·kg-1，定 量 限 為1.0 μg·kg-1，線 性 范 圍 為0.1～10.0 μg·L-1，對應化合物的線性方程、相關系數見表2，以峰面積為縱坐標，標準溶液質量濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，各藥物線性方程相關系數r＞0.995。酰胺醇類物質總離子圖見圖1，各單一組分離子對圖見圖2。

圖2 各單一組分離子對圖

表2 各類藥物的工作曲線及相關系數表

圖1 酰胺醇類物質總離子圖

2.3 回收率與精密度

選用不含本文5種酰胺醇類藥物的陰性蜂蜜樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗[7]，每個濃度的加標試驗做6次平行。取各藥物的加標量、相應的回收率平均值，結果見表3。

表3 陰性蜂蜜樣品中酰胺醇類藥物的平均回收率和相對標準偏差表（n=6）

2.4 方法實際應用

在合肥商超隨機購買15批次蜂蜜樣品，用本文方法進行檢測，實驗結果均為未檢出，未發現酰胺醇類陽性樣品[8]。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留量。5種酰胺醇類藥物在0.1～10.0 μg·L-1的濃度范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.995；方法檢出限為0.1 μg·kg-1。加標水平在0.1～5.0 μg·kg-1范圍內，蜂蜜基質中平均回收率在86.3%～101.0%，相對標準偏差RSD≤6.5%。該方法快速、準確、靈敏，可用于測定蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留。