除脂固相萃取小柱結合LC-MS/MS測定豬肉中四環素類殘留量

◎ 張志輝，孫章敏

（昭通市質量技術監督綜合檢測中心，云南 昭通 657000）

長期食用含四環素類抗生素食物易引發過敏反應或中毒現象，因此定性定量測定食品中四環素類殘留對維護食品安全具有重要意義。本實驗采用除脂固相萃取小柱Captiva EMR-Lipid結合LC-MS/MS在國家標準的方法基礎上進行優化改進，探究方法的可行性[1-4]。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

液相色譜-串聯質譜-質譜儀（AB科技有限公司，AB4500）、超聲波清洗器（江蘇省昆山市淀山湖鎮，KQ5200DB）、氮吹儀(上海安普實驗科技股份有限公司，EFAA-DC24)、冷凍離心機（美國貝克曼公司、ALLEGRAX-30R）、分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204）、旋轉蒸發儀（BUCHI科技有限公司，ROTAVAPORR210）、渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，VOJEX-5）、6 mL Captiva EMR-Lipid和HLB小柱（安捷倫科技有限公司）、0.22 μm有機濾膜、注射器及色譜瓶。

0.2 mg鹽酸四環素（中國食品藥品檢定研究院）、0.25 g鹽酸多西環素（農業部環境保護科研檢測所）、0.2 g鹽酸金霉素（Dr.Ehrenstorfer）和100 μg·mL-1鹽酸土霉素（中國食品藥品檢定研究院）標準物質。乙腈（賽默飛世爾科技有限公司）、甲酸（阿拉丁試劑上海有限公司）、甲醇和乙酸乙酯（默克股份有限公司），為色譜純；檸檬酸和磷酸氫二鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（四川西陵化工有限公司），為分析純。

1.2 實驗條件

色譜柱-ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。離子化模式：電噴霧電正離子模式（ESI+）；質譜掃描方式：多反映監測（MRM）；氣簾氣（CUR）：241.32 kPa；離子化電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；GS1：50 ℃；GS2：50 ℃；進樣量：3 μL；色譜柱流速：0.300 0 mL·min-1。洗脫梯度見表1，質譜條件見表2。

表1 洗脫梯度和質譜條件表（單位：%）

表2 質譜參數表

1.3 標準溶液配制

稱取標準物質：四環素0.011 00 g、多西環素0.011 69 g、金霉素0.010 76 g分別于100 mL容量瓶定容得100 μg·mL-1后，各取1 mL定容至10 mL得10 μg·mL-1；取0.5 mL標 液 土 霉 素 定 容 至5 mL得10 μg·mL-1。

上述標液各取2.5 mL于50 mL容量瓶定容得500 ng·mL-1混合標準液。分別取10 μL、20 μL、40 μL、80 μL、120 μL和160 μL，定容到1 mL得5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1和80 ng·mL-1的梯度標液。

1.4 樣品制備

豬肉攪碎后取2.00 g于50 mL離心管，加20 mL 0.1 moL·L-1EDTA緩沖溶液，振蕩2 min，超聲5 min。取上清液2 mL于離心管中，加入8 mL1%甲酸乙腈混勻，上述溶液經Captiva EMR-Lipid小柱過濾至雞心瓶。用2 mL80%乙腈+1%甲酸水沖洗，40 ℃氮吹儀吹至近干。用1 mL乙腈+0.1%甲酸水（1+19）定容，過有機濾膜裝色譜瓶，經過LC-MS/MS測定。

空白樣品按照優化方法提取后配制基質溶液。

2 結果與分析

2.1 實驗條件選擇

經大量實驗，選擇1.4色譜條件。土霉素、多西環素、四環素、金霉素分別在2.52 min、2.95 min、2.96 min、3.45 min時出峰。測定空白樣品中無四環素類抗生素，因此采用外標法進行實驗。

2.2 回收率測定結果

稱豬肉2.00 g，分別加入500 ng·mL-1的混合標準儲備液20 μL、80 μL、400 μL，按1.4提取方法，在1.4條件下經LC-MS/MS檢測。樣品中不含四環素、多西環素、金霉素和土霉素殘留，且回收率均在83.8%～97.2%，回收率滿意，詳見表3。

表3 4種四環素類抗生素回收率表

2.3 檢出限與定量限

選取濃度標樣1 ng·mL-1、5 ng·mL-1連續測10次，確定基線噪音值（S/N），求平均值，根據3倍信噪比計算檢出限，10倍信噪比計算定量限。4種四環素類抗生素檢出限與定量限見表4。

表4 檢出限與定量限表

2.4 精密度

3個測定濃度下重復測定6次，相對標準偏差RSD值為1.274%～4.641%，根據GB/T 27404—2008可知，精密度良好[5]。4種四環素類抗生素加標濃度和RSD值見表5。

表5 4種四環素類抗生素加標濃度和RSD值表

3 結論

本文采用除脂固相萃取小柱Captiva EMR-Lipid結合LC-MS/MS在國標方法的基礎上進行優化改進，4類抗生素的檢出限均小于國標檢出限，此方法前處理時間短，配合高靈敏度檢測器，可在較短時間實現對樣品的處理及測定，對測定新鮮動物源性食品中獸藥殘留量有一定實際應用意義。