超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺的殘留量

◎ 刁玉華，張加穩

（昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032）

金剛烷胺是飽和三環癸烷的氨基衍生物，屬于三環胺類。1966年，人類首次研究發現金剛烷胺具有抗病毒的功效，其于1976年成為美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）首次批準的抗病毒藥物，主要用于預防亞洲甲型流感病毒的感染，臨床上還被用于治療帕金森綜合征、丙型肝炎和多發性硬化癥[1-2]。大型流感的爆發會造成畜禽動物極高的發病率和死亡率，養殖戶為降低經濟損失，將金剛烷胺類藥物添加至飼料中用于畜禽流感的預防和治療，然而非法使用金剛烷胺類藥物會造成動物體內藥物殘留，加大病毒的耐藥性和變異性，人體食用后會損傷生殖系統[3-4]。因此，包括我國在內的多個國家已將金剛烷胺列為禁用藥物，且2017年原農業部印發的《關于動物及動物產品獸藥殘留監控計劃的通知》將其定為首個監控項目[5]。

目前，金剛烷胺的檢測方法有高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、酶聯免疫法[9]、電化學法[10]、微流控芯片法[11]和高效液相色譜-串聯質譜法[12-13]等。高效液相色譜-串聯質譜法已經成為近年獸藥殘留檢測分析的主要方法，具有靈敏度高、基質干擾小、高通量及定性定量更準確等優點。查閱文獻可知，關于肉制品中金剛烷胺殘留量檢測的相關報道較多[14-16]，提取溶劑多采用甲醇或乙腈與有機酸混合提取，而進出口行業標準《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留的測定液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 4253—2015）[17]僅以三氯乙酸作為提取溶劑，提取液均用混合陽離子固相萃取柱凈化，實驗驗證后發現上述方法的提取效率和重現性均不理想，而關于其他提取溶劑和固相萃取柱的相關研究報道又較少。故本實驗選取市售雞蛋為基質樣品，分別對提取溶劑、固相萃取柱進行優化研究，最終建立了系統的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，可為雞蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯及異丙醇，均為色譜純，購自默克股份兩合公司；甲酸、乙酸、三氯乙酸、鹽酸、氨水、乙酸銨，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

材料：金剛烷胺標準品（中國食品藥品檢定研究院），Cleanert C18、Oasis HLB、PCX、MCX、SCX、WCX共6種固相萃取柱（均為天津博納艾杰爾科技有限公司），BHE Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美國沃特世公司）。

1.2 儀器與設備

QTRAP 4500超高效液相-三重四級桿串聯質譜儀（配有電噴霧離子源ESI及MultiQuant3.0.2數據處理系統，美國AB SCIEX公司）、JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器）、SK8210HP超聲波清洗儀（上海科導）、Reacti-Therm氮吹儀（美國賽默飛世爾公司）、arium? comfort II超純水機（德國賽多利斯公司）、S220K精密pH計（梅特勒-托利多公司）。

1.3 方法與過程

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取金剛烷胺標準品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度配制成100 μg·mL-1的標準儲備液，4 ℃冰箱中避光保存備用。

取100 μg·mL-1的 標 準 儲 備 液 用 乙 腈 配 制 成1 μg·mL-1標準使用液，用30%乙腈稀釋標準使用液為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1的系列標準溶液，待用。

1.3.2 樣品前處理

（1）實驗樣品制備。選取市售雞蛋去殼用組織搗碎機搗碎，裝入自封袋中，冷藏、避光保存，備用。

（2）提取。準確稱取均勻試樣5 g，于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-2.0%三氯乙酸溶液（1∶1，V/V），漩渦混勻3 min，再超聲提取10 min，8 000 r·min-1離心5 min，取出上清液，再重復提取一次，離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度待凈化。

（3）凈化。依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸活化混合陽離子交換固相萃取小柱，準確移取5 mL稀釋液過柱，依次用5 mL甲酸溶液、3 mL1%甲酸乙腈淋洗，棄去全部流出液；用2×2 mL甲醇-氨水-乙酸銨（95+2.5+2.5）洗脫至10 mL試管中，在40 ℃下用氮吹儀吹至近干。準確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水（70+10+20）溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3 液相色譜-串聯質譜條件

（1）液相條件。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為含0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫條件表

（2）質譜條件。ESI-MS/MS條件：正離子掃描；MRM多反應監測；氣簾氣流速為38 L·h-1，離子源霧化氣流速為55 L·h-1，離子源輔助加熱氣流速為55 L·h-1，噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度為550 ℃；優化后的相關參數見表2。

表2 金剛烷胺保留時間及質譜參數表

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

金剛烷胺分子結構中含有胺基基團，在質譜檢測離子化過程中，容易形成穩定的[M+H]+離子，故采用電噴霧正離子（ESI+）掃描模式。正離子掃描模式下，在液相色譜流動相中加入少量的甲酸會增強待測化合物的響應強度，原因是甲酸會電離出更多的H+，因此本實驗選用0.1%的甲酸水溶液與乙腈為流動相，由于金剛烷胺含有胺基基團，極性較強，故采用BHE Amide色 譜 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Waters）進行梯度洗脫，保證有較好的峰形和響應強度。建立優化后的液相色譜參數和質譜參數后對加標樣品溶液采集的離子色譜峰圖分別如圖1所示。

圖1 金剛烷胺加標溶液的MRM離子色譜圖

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的優化

金剛烷胺分子結構含有胺基，極性較強，根據相似相溶原理，易溶于強極性有機溶劑中，故本實驗分別比較甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷以及乙酸乙酯等不同極性的有機溶劑分別與2.0%的甲酸、乙酸、鹽酸和三氯乙酸等以1∶1體積混合進行提取。其中，異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑的提取效果最好，原因可能是金剛烷胺的極性與異丙醇相似，且三氯乙酸可沉淀蛋白，減少基質干擾，因此本實驗選用異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑。

2.2.2 凈化柱的優化

金剛烷胺分子結構中含有胺基，在酸性條件下呈陽離子狀態，故目前實驗室多采用陽離子交換固相萃取柱對提取液進行凈化。本實驗分別比較了MCX、PCX、SCX、WCX、HLB和C18固相萃取柱對目標物提取液的凈化效果，實驗結果如圖2所示。

圖2 不同固相萃取柱凈化下金剛烷胺的提取回收率圖

由圖2可知，采用Oasis MCX比其他5種固相萃取柱凈化回收率高，原因可能是其填料對金剛烷胺所形成的[M+H]+離子吸附作用較強，且易于洗脫，因此本實驗選擇Oasis MCX作為固相凈化柱。

2.3 校準曲線、檢出限和定量限

金剛烷胺的質量濃度在5.0～100.0 ng·mL-1時，其目標物定量離子對的峰面積與其質量濃度的線性關系良好，相關系數為0.999 1，線性回歸方程為y=48 324x +174 820。以信噪比S/N=3時對應的濃度作為方法的檢出限，信噪比S/N=10時對應的濃度為定量限，得到金剛烷胺的檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個濃度水平的金剛烷胺標準溶液，每個水平進行6次平行實驗，按照優化的實驗方法測定，計算其加標回收率及精密度。

實驗結果見表3，加標樣品中金剛烷胺的平均回收率為87.5%～97.6%，相對標準偏差均小于6%，GB/T 27404—2008規定被測組分含量小于100 μg·kg-1，回收率為60%～120%、精密度21%～30%[18]，可見本方法加標回收率和精密度較好。

表3 樣品加標回收率實驗結果表（n=6）

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺殘留量的分析方法。分別對提取溶劑、固相萃取柱、儀器條件做了優化研究，優化后的實驗方法為以異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）為提取溶劑、以Oasis MCX為固相萃取凈化柱對樣品進行前處理，再以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相，采用ESI正離子模式電離，多級反應監測（MRM）進行檢測。實驗結果顯示，本方法相關系數為0.999 1，檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，回收率為87.5%～97.6%，相對標準偏差均小于6%。可見該方法操作簡便、快速，前處理干凈，基質干擾小，回收率高、重復性好，滿足大批量禽蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析。