靜態頂空氣相色譜法測定酒中的乙酸乙酯和己酸乙酯

◎ 何 靖，何焜鵬

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東 廣州 511442）

中國酒文化源遠流長，制酒歷史悠久。酒由谷物、水果等發酵釀制而成[1]，按生產工藝主要分為蒸餾酒、發酵酒和配制酒。酒的主要成分是乙醇和水，而溶于其中的醇、醛、酸和酯等化合物作為酒的香味物質[2]。酯類化合物在酒中具有芳香型，是酒體芳香形成的主要原因[3]。其中乙酸乙酯在各種香型白酒中含量占比大，在白酒香氣成分扮演主要角色。不同酯類含量的高低決定了白酒的香型，如清香型白酒是以乙酸乙酯為主體香味成分的白酒，濃香型白酒的主體香味成分是己酸乙酯，而鳳香型白酒則以乙酸乙酯及己酸乙酯為主體。各白酒的特征香氣成分雖不盡相同，但都由酯類物質作為特征香味。

目前測定乙酸乙酯和己酸乙酯主要采用氣相色譜法。現國標《白酒分析方法》（GB/T 10345—2007）中明確了乙酸乙酯和己酸乙酯的分析方法，采用氣相色譜內標法進行測定；黃偉等[4]采用內標法與外標法對白酒中乙酸乙酯含量進行了比較；也有文獻探究了紅外光譜組合區間偏最小二乘法定量白酒中乙酸乙酯的含量[5]。鑒于目標化合物沸點低，易揮發，本文采用靜態頂空色譜法測定酒中乙酸乙酯和己酸乙酯。酒在釀制過程中除了產生特征香味物質[6]還產生不易揮發物質，如氨基酸、維生素、有機酸、肉豆蔻酸、硬脂酸以及棕櫚酸等[7]，頂空進樣有利于消除基質干擾，減少污染物進入色譜系統，且操作簡單，靈敏度高，容易實現。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀配置FID檢測器（安捷倫科技有限公司）、G1888頂空進樣器（安捷倫科技有限公司）、十萬分之一天平（奧豪斯（常州）有限公司）。

標準品：乙酸乙酯（99.7%，Dr.Ehrenstorfer）、己酸乙酯（100%，CNW），乙醇（色譜純，霍尼韋爾公司），超純水（一級，Milli-Q），實驗中的酒樣均購買于當地超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

40%乙醇溶液：移取200 mL無水乙醇于500 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻待用。

95%乙醇溶液：移取95 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻待用。

標準儲備液的配制（5 mg·mL-1）：分別準確稱量乙酸乙酯、己酸乙酯各0.1 g（精確到0.000 01 g），置于兩個20 mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。

標準工作曲線的配制：分別準確吸取乙酸乙酯標準儲備液和己酸乙酯標準儲備液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL和2.50 mL于25 mL容量瓶，用40%乙醇溶液稀釋至刻度線，得到濃度分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、250 mg·L-1和500 mg·L-1的 標準混合工作曲線。準確移取5.00 mL于頂空瓶中，壓蓋密封，上機測定。

1.2.2 樣品前處理

將酒樣混勻，從中準確移取5.00 mL于20 mL頂空瓶，密封頂空瓶蓋，待測。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：CP-Wax 57（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；柱溫升溫程序：初溫40 ℃保持3 min以5 ℃·min-1的速率上升至100 ℃保留1 min；進樣口：溫度200 ℃；進樣量1 mL，分流進樣，分流比5∶1，分流流量為7.5 mL·min-1；氫火焰離子化檢測器（FID）：溫度300 ℃，氫氣40 mL·min-1，空氣400 mL·min-1，尾吹30 mL·min-1；載氣：高純氮氣，尾吹25 mL·min-1；色譜柱流量1.5 mL·min-1。頂空條件：平衡條件，平衡溫度60 ℃，定量環溫度70 ℃，傳輸線區溫度80 ℃。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線配制溶液的選擇

樣品直接上頂空測定，為準確定量，理論上標液所處頂空瓶的基質環境應與樣品的基質環境保持相似，因此優先選用與樣品酒精度相仿的乙醇溶液進行標準工作曲線的配制。

不同類型的酒酒精度各不相同，葡萄酒酒精度在8%Vol～15%Vol，啤酒酒精度在3%Vol～5%Vol，果味米酒酒精度約10%Vol，大部分白酒酒精度在30%Vol～40%Vol。樣品酒精度范圍廣，配制一條曲線無法覆蓋酒中所有基質情況。用乙醇含量低的溶液配制曲線容易出現乳化現象，造成乙酸乙酯和己酸乙酯溶解不充分，用乙醇含量過高的溶液配制曲線，與酒樣環境有差異，造成目標化合物在標曲和酒樣的溶解和揮發程度不一致，難以準確定量。最終選用40%乙醇溶液作為曲線的配制溶液。40%乙醇溶液能充分溶解乙酸乙酯和己酸乙酯，且與大部分酒的基質環境相似，配制出的曲線線性關系較好，線性系數均在0.999以上。

2.2 色譜柱的選擇

本方法采用非極性、中極性和強極性色譜柱對乙酸乙酯和己酸乙酯的出峰情況進行比對，混標配制濃度為100 mg·L-1，分別使用DB-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）3條不同極性色譜柱，在1.2.3的色譜條件下運行100 mg·L-1混標標點，探究其出峰情況。因乙酸乙酯和己酸乙酯的極性較強，使用非極性色譜柱DB-1和中等極性DB-17得到的目標峰峰型較差，不能很好地保留化合物。而DB-Wax極性較強，與乙酸乙酯、己酸乙酯極性相似，能使乙酸乙酯和己酸乙酯得到較強保留和實現分離，因此選用極性色譜柱。

在實際試驗測定白酒的乙酸乙酯、己酸乙酯時，發現白酒中乙酸乙酯和乙縮醛保留時間幾乎完全重合，采用調低初溫、減緩升溫速率等方法讓其實現分離，效果不甚理想。選用有更好分離優勢的極性色譜柱，發現使用CP-Wax 57能將乙酸乙酯和乙縮醛分離開，且分離效果較好，目標峰峰型對稱尖銳，響應值大，使用該柱子得到的目標化合物色譜圖見圖1。

圖1 CP-Wax 57測定白酒的氣相色譜圖

2.3 頂空平衡溫度與平衡時間的探究

頂空平衡溫度越高，有機物揮發程度越高，目標化合物含量的增加可以提高響應值和儀器靈敏度。由于樣品主要成分是水和乙醇，如果設置平衡溫度過高，頂空瓶瓶壓升高或樣品沸騰，容易造成頂空瓶內氣體泄漏或頂空瓶破裂等情況，故本試驗選取50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃作為平衡溫度，配制100 mg·L-1標準濃度點，控制頂空平衡時間為30 min，檢測被測物質的響應值，以探究本實驗合適的頂空平衡溫度。測試結果發現隨著溫度升高，被測物響應值增大，在60 ℃以后響應值增速減緩并趨于穩定。由于酯類物質沸點較低，為防止爆沸，最終選擇60 ℃作為最優平衡溫度。

控制頂空平衡溫度為60 ℃，考察標準濃度點在平衡時間為20 min、30 min、40 min和50 min時被測物響應值的大小，用于探究合適的頂空平衡溫度。結果顯示，隨著平衡時間延長，被測物響應增大，當平衡時間超過30 min，被測物響應值幾乎不再增大，且平衡時間過長可能造成酯類物質的熱分解，因此選擇30 min作為平衡時間。

綜上，本方法以平衡溫度60 ℃，頂空平衡30 min作為最優頂空條件。

2.4 線性范圍及檢出限

以標準工作液濃度為橫坐標，化合物峰面積為縱坐標，繪制校正曲線。乙酸乙酯線性回歸方程為Y=0.770 7X+1.074 4，線 性 擬 合R=0.999 96；己酸乙酯線性回歸方程為Y=0.727 9X+3.621 9，線性擬合R=0.999 57。結果表明乙酸乙酯和己酸乙酯在20～500 mg·L-1線性關系良好，線性系數均在0.999以上。逐級稀釋標準品儲備液，以信噪比S/N=3時的濃度為本方法的檢出限，得到乙酸乙酯檢出限為0.8 mg·L-1，己酸乙酯檢出限為1.0 mg·L-1。

2.5 樣品加標回收實驗和重復性實驗

從商場購得多種酒樣，按照1.2方法，在3個不同添加水平下進行加標回收實驗和精密度實驗，以考察乙酸乙酯和己酸乙酯的加標回收率和精密度情況，結果見表1。平均回收率在93.9%～104.0%，精密度在4.0%以下（n=6）。

表1 不同酒樣不同添加濃度下乙酸乙酯、己酸乙酯的回收率和精密度表（n=6）

2.6 實際樣品測定

從商場購得多種酒樣，能覆蓋到酒的類別盡可能多，按照1.2的方法對樣品進行測定。具體結果見表2。由表2可知，酒中檢出乙酸乙酯含量基本在200 mg·L-1以上。己酸乙酯檢出率較低，只有以己酸乙酯和乙酸乙酯為主體的鳳香型白酒檢出己酸乙酯含量較高，該酒符合國家標準GB/T 14867—2007一級低度鳳香型白酒的限值要求。

表2 不同基質的酒乙酸乙酯、己酸乙酯的測定值表

3 結論

本文采用靜態頂空進樣方式測定各種酒中乙酸乙酯和己酸乙酯含量，對色譜柱的選擇、頂空條件的確定、樣品回收率及穩定性等方面進行探究。本方法采用標準曲線進行定量，較《白酒分析方法》（GB/T 10345—2007）中的單點校正的定量更加準確，且適用范圍廣，不僅限于白酒，還適用于成分復雜的配制酒、果酒、中藥保健酒等。靜態頂空進樣可以減少各種基質中脂類、糖分、蛋白質等非揮發性物質對色譜系統的污染，且得到的目標化合物在峰寬、峰型、基線平穩度等方面更具有優勢。本方法目標化合物的相關性良好、檢出限低、樣品的加標回收好、精密度好，實驗過程簡單，適用于各種酒中乙酸乙酯、己酸乙酯含量的測定。