沙門氏菌鑒定和分型方法比對研究

◎ 李赫婧，王立平，楊紅蓮，薛晨玉，王 丹

（北京市食品安全監控和風險評估中心，北京 100094）

沙門氏菌是食源性疾病重要的致病菌，我國每年由沙門氏菌引起的中毒事件屢居首位[1]。依據現有食品安全國家標準[2]，食品中沙門氏菌的鑒定和分型多采用常規生化鑒定的方法，檢測周期長，操作煩瑣，費力、耗時，無法滿足食品安全突發事件應急檢驗的要求[3]。采用合適的鑒定和分型方法，對致病菌的快速溯源具有重要意義[4-5]。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDITOF-MS）是近幾年發展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的生物質譜技術，該方法基于細菌全細胞蛋白質組指紋圖譜分析，通過與標準物質圖譜數據庫或者自建數據庫進行比較，可以鑒定至屬、種，乃至亞種的水平，具有快速、準確、通量高、成本低等優點，適用于微生物的高通量篩選[6-8]。傳統的血清學分型使用血清玻片凝集作為早期沙門氏菌分型方法，該方法直觀可靠，是大多數實驗室使用的分型方法。但存在耗時長，對實驗人員操作經驗有要求，血清質量參差不齊而導致結果偏差等不足之處。多位點序列分型（MLST）是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，該方法通過對多個管家基因內部片段進行序列測定，分析菌株的變異，配合使用EnteroBase數據庫提供的物種持家基因信息比對獲得沙門氏菌各菌株的MLST分型，從而為沙門氏菌分型提供更高的分辨力和更明確的分型方法[9-10]。

本文采用生化鑒定和MALDI-TOF-MS對雞肉中分離的沙門氏菌進行種屬鑒定，采用傳統血清學方法和MLST分子手段進行血清型分型，比較不同的技術手段具有的優缺點，剖析其方法機制，為實驗室進行沙門氏菌鑒定以及權衡每種分型技術的利弊提供參考，使實驗室能更好地根據菌株特性、分型目的和實驗室擁有的條件選擇合適方法進行相關研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

生雞肉樣品，購自北京市市場；BPW培養基、XLD培養基、SC培養基、營養瓊脂、營養肉湯、SWARM瓊脂等，購自北京陸橋培養基公司；沙門顯色培養基，購自法國科瑪嘉公司；腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒，購自法國梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，購自丹麥SSI公司；PCR預混液和細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物，由北京生工生物技術有限公司合成；IVD BTS、IVD HCCA，購自德國布魯克公司；乙腈、乙醇、三氟乙酸、甲酸和無水乙醇，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Sigma 3K18離心機、電熱恒溫水浴、Bio-RAD MyCyclerTM PCR儀、Bio-RAD電 泳 儀、Bio-RAD Gel Doc XR凝膠成像分析系統、布魯克基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、Nanodrop分光光度計。

1.3 沙門氏菌初篩

參照GB 4789.4—2016[2]方法進行生雞肉中沙門氏菌的初篩。無菌操作稱取25 g樣品，置于盛有225 mL BPW的無菌均質袋中，均質1 min左右，于36 ℃培養箱中培養18 h。各移取1 mL增菌液轉接種于10 mL TTB和10 mL SC內，分別于42 ℃和36 ℃培養箱中培養24 h。取TTB及SC培養液各1環，分別接種于一個BS瓊脂平板、一個XLD瓊脂平板和一個沙門氏菌顯色平板，于36 ℃培養箱中分別培養48 h、24 h和24 h，觀察菌落形態，挑取可疑菌落進行后續試驗。

1.4 生化鑒定

挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌使用腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒進行生化鑒定，參照其說明書進行操作，將各反應管結果記錄于報告單上。計算數據得到7位數字編碼，通過APILAB PLUS鑒定軟件得到鑒定結果。

1.5 質譜鑒定

使用MALDI-TOF-MS進行質譜鑒定，挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌涂抹在樣品靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫干燥，再滴加1 μL HCCA基質溶液，室溫干燥，將靶板放入儀器內，設定檢測參數，進行質譜數據采集。

1.6 MLST分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行沙門氏菌基因組提取，核酸質量使用Nanodrop分光光度計進行測定。選取沙門氏菌7個管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA進行MLST分型，7個基因的擴增引物和測序引物參照SN/T 4525.1—2016合成[11]。

PCR反應體系（20 μL）：PCR預混液（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）和下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模 板1 μL，超 純 水7 μL。PCR反 應 條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃充分延伸5 min，最后4 ℃保存。

將PCR擴增產物送至生工生物技術有限公司進行測序，測序結果上傳至EnteroBase數據庫進行MLST分型。

1.7 血清分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，以生理鹽水作為對照，參照GB 4789.4—2016[2]的方法進行O抗原和H抗原的血清分型。依次用O因子多價血清做凝集實驗，判定O群，再進行O復合因子血清或單因子血清的核對。確定O價抗原因子后，根據H抗原表所述H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原[12]。

2 結果與分析

2.1 生化鑒定結果

經過選擇性平板分離初篩，31個生雞肉樣品中共篩出15株可疑沙門氏菌，對其進行API生化鑒定，結果顯示其中11株為沙門氏菌屬，生化型分為6704552和6704752兩種，具體生化鑒定結果詳見表1。

2.2 質譜鑒定結果

對15株可疑沙門氏菌進行MALDI-TOF-MS鑒定，將采集的質譜數據導入儀器中自帶微生物指紋圖譜庫進行比對，比對運算后得到鑒定結果，查看鑒定分值，其中11株菌鑒定為沙門氏菌屬，具體質譜鑒定結果詳見表1。

表1 生化和質譜鑒定結果表

2.3 MLST分型結果

將MLST測序結果上傳至EnteroBase數據庫（http：//mlst.war-wick.ac.uk/mlst）進行在線數據分析，11株菌共包含5個ST型，其中ST19型（5株）、ST34型（1株）和ST29型（1株）預測為鼠傷寒沙門菌，ST11型（3株）預測為腸炎沙門氏菌，ST1628型1株（EnteroBase數據庫中未對該ST型進行血清型預測）。MLST具體分型及預測血清型結果詳見表2。

表2 MLST和血清分型結果表

2.4 血清分型結果

使用丹麥SSI血清對11株沙門氏菌進行血清學分型實驗，共檢出3種血清型，分別為3株腸炎沙門氏菌、7株鼠傷寒沙門氏菌和1株里定沙門菌，具體血清學分型結果詳見表2。

2.5 生化和質譜鑒定結果比較與分析

本次對15株可疑沙門氏菌進行API生化鑒定和MALDI-TOF-MS質譜鑒定，結果顯示兩種方法對15株菌的鑒定結果均一致。生化鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定均能較準確的鑒定到沙門氏菌屬或種的水平，但是兩者的檢測用時和檢測成本不同。相比較傳統生化鑒定方法，質譜方法具有快速、成本低、結果重復性好等特點，一次實驗可以同時檢測96個樣品，可作為沙門氏菌高通量初篩的方法，經初篩為陽性的目標菌再通過生化鑒定等金標準方法進行確證，這樣會大大提高目標菌的發現率。

2.6 血清和MLST分型結果比較與分析

本次對11株沙門氏菌分別用血清和MLST進行分型，結果顯示沙門菌血清型和ST型有高度的相關性，其中10株菌MLST的預測結果與血清學分型結果完全一致，ST11對應腸炎沙門氏菌，ST19、ST34和ST29對應鼠傷寒沙門氏菌，僅有一株菌（樣品號LHJ-7）MLST分型為ST1628，EnteroBase數據庫顯示沒有對應的預測血清型，其血清學分型結果為里定沙門氏菌，可能由于該菌株在某一MLST基因位點上有突變導致與血清學結果偏差。以血清分型方法為參照方法，本次實驗MLST對沙門氏菌分型的準確度為90.9%（10/11）。

血清學與MLST在沙門氏菌分型上均表現出較好的鑒定能力，但血清分型操作相對復雜，對實驗人員操作經驗有一定要求，其檢測結果受制于試劑質量，目前各廠商血清質量參差不齊，部分菌株由于變異存在無法分型或交叉凝集等錯誤結果。相比較于血清學分型，MLST分型具有操作相對簡單、成本低、實驗用時短、結果更加精準的優勢。如將MLST與血清分型聯合使用，先通過MLST對菌進行血清型預測，再有針對性的進行血清學分型實驗，將會極大提高血清分型的效率，尤其對于一些不常見的血清型，往往需要全套的診斷血清進行分型，如果有血清預測結果，也會降低對血清試劑的依賴，降低實驗成本。

3 結論

文章對生雞肉樣品進行沙門氏菌分離鑒定與分型，共分離出疑似沙門氏菌15株，同時采用API生化及質譜兩種方法對沙門氏菌進行鑒定，共鑒定出11株沙門氏菌，結果顯示生化與質譜鑒定結果一致。分別采用血清學和MLST兩種方法對11株沙門氏菌進行分型，結果顯示MLST共測出5種ST型，血清分型為3種。通過結果比較得出沙門菌血清型和ST型有高度的相關性，其中10株菌MLST的預測結果與血清學分型結果完全一致。

質譜方法具有快速、成本低、結果重復性好等特點，文章僅使用儀器自帶數據庫對沙門氏菌進行屬水平的鑒定，如果通過自建數據庫，可以對沙門氏菌進行種和亞種水平的鑒定，同時還具有良好的分型能力，可以作為沙門氏菌快速鑒定的一種補充方法。MLST操作簡單，能快速得到結果并且便于不同實驗室結果之間的比較，已經用于多種細菌的流行病學監測和進化研究。隨著測序速度的加快、成本的降低以及分析軟件的發展，MLST有望成為細菌的常規分型方法。