下調miR-4295靶向CDKN1A調控膠質瘤U251細胞增殖和侵襲

王小言 夏鷹 金虎 陳偉明 陳曉東 聶柳 鄭忠濤

(海口市人民醫院神經外科，海南 海口 570208)

膠質瘤是常見的惡性腫瘤，有易轉移、易復發、惡性程度高等特點，單純的手術治療難以徹底根治膠質瘤，術后輔助放療、化療等是目前常見的膠質瘤治療手段，基因治療是近年來受到廣泛關注的治療途徑，也是目前研究的熱點〔1〕。miRNA不僅參與機體正常生長發育，調控細胞的生長、分化等過程，還與人類的多種疾病發生有關，例如心血管系統疾病、免疫系統疾病、神經系統疾病及腫瘤〔2,3〕。miR-4295是最近研究發現的與腫瘤有關的miRNA，在肺癌、膀胱癌等腫瘤中扮演促進作用，miR-4295能促進腫瘤細胞的生長和侵襲〔3～5〕。miR-4295在膠質瘤組織中過表達，并且其表達水平與患者的臨床分期有關〔6〕。現階段對miR-4295在膠質瘤中的作用尚不明確。本實驗探討下調miR-4295對膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響和靶向調控機制，為基因靶向治療膠質瘤及明確miR-4295在腫瘤中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 膠質瘤U251細胞購自美國ATCC；miR-4295 inhibitor、inhibitor control、miR-4295 mimics、mimics control均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建；CDKN1A抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CDKN1A siRNA、siRNA control由上海吉凱基因化學技術公司構建；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；熒光素酶報告載體由漢恒生物科技(上海)有限公司構建；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組 膠質瘤U251細胞分為control組(未轉染)、anti-NC組(轉染inhibitor control)、anti-miR-4295組(轉染miR-4295 inhibitor)，細胞轉染操作步驟同Lipofectamine2000轉染試劑。

1.2.2qRT-PCR檢測下調效果 取培養48 h后的control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細胞，添加Trizol試劑，分別提取細胞中的RNA，使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄反應，取cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq進行qRT-PCR，PCR條件分成兩步，第1步為：95℃孵育30 s，第2步為：95℃孵育5 s，60℃孵育30 s，一共循環40次。利用Stepone Plus Realtime PCR System分析每個反應的Ct值，依照2-△△Ct方法計算miR-4295表達變化。引物序列為：miR-4295正義鏈5′-UCCCUCCCCAGUUCAUUGCACUU-3′，反義鏈5′-AAGUGCAAUGAACUGGGGAGGGA-3′。內參U6正義鏈5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′。

1.2.3四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定下調miR-4295后膠質瘤細胞增殖能力 將control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細胞接種到96孔板，每個孔內加100 μl的細胞懸浮液(含有4×103個細胞)，培養48 h后，將培養板取出，添加10 μl的MTT工作液，放在37℃繼續反應4 h。把孔內的上清溶液棄掉，依次添加二甲基亞砜(DMSO)溶液(每孔150 μl)，孵育反應10 min。測定酶標儀波長為490 nm的OD值。

1.2.4流式細胞術測定下調miR-4295后膠質瘤細胞凋亡水平 取control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細胞，常規方法培養48 h，以胰蛋白酶消化成單細胞懸浮液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后將各組細胞懸浮在400 μl的結合緩沖液中，在細胞中添加PI及AnnexinV-FITC染色液(各5 μl)，充分混合后，立即用流式細胞儀測定各組細胞凋亡水平。

1.2.5Transwell小室測定下調miR-4295后膠質瘤細胞侵襲和遷移能力 取轉染后的control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細胞，按照每孔中添加8×104個細胞種植到8 μm的Transwell小室中，細胞培養液為不含血清的DMEM，同時在下室內補充600 μl的含有10%胎牛血清的DMEM。培養48 h后，用甲醇將遷移的細胞固定，使用棉簽把沒有遷移的細胞擦掉。用0.1%的結晶紫染色，在顯微鏡下隨機選擇5個視野分析計數遷移細胞數目。細胞侵襲實驗步驟同遷移實驗，在實驗前用基質膠將小室濕化。

1.2.6靶基因預測和鑒定 利用在線靶基因預測軟件分析miR-4295同CDKN1A的3′UTR端有結合位點，合成含有野生型(WT)和突變型(MUT)CDKN1A的3′UTR端寡聚核苷酸的熒光素酶報告載體(pmiRGLO)。使用Lipofectamine2000將miR-4295 mimics、mimics control分別同WT、MUT共轉染到膠質瘤細胞中，在培養48 h后，使用熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶的活性。

1.2.7Western印跡檢測下調miR-4295后膠質瘤細胞中CDKN1A蛋白表達 取control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細胞，常規方法培養48 h，在細胞中加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA蛋白提取試劑，置于低溫(4℃)中收集細胞，使用BCA法對蛋白濃度進行定量。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。把收集的蛋白樣品添加到1/4體積的5×上樣緩沖液內均勻混合，然后放在沸水浴中反應5 min。在每個孔中添加30 μg蛋白樣品，濃縮膠中以90 V電壓電泳，分離膠中以120 V電壓電泳，等到溴酚藍已經到達凝膠底部之后關閉電源。把NC膜剪成合適大小，置于80 V、冰浴條件下電轉膜45 min，用5%脫脂奶粉封閉后，同1∶1 200稀釋的CDKN1A一抗結合反應2 h，再與1∶3 000稀釋后的二抗結合2 h，最后用電化學發光(ECL)。根據條帶的灰度值分析CDKN1A蛋白水平，內參為GAPDH。

1.2.8CDKN1A siRNA對下調miR-4295的膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移影響 利用Lipofectamine 2000將miR-4295 inhibitor、CDKN1A siRNA共轉染到膠質瘤細胞中，記為anti-miR-4295+si-CDKN1A組，同時將miR-4295 inhibitor、siRNA control共轉染到膠質瘤細胞中，記為anti-miR-4295+si-NC組，轉染后48 h，用Western印跡測定細胞中CDKN1A蛋白表達，MTT測定細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室測定細胞侵襲和遷移，步驟同上。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-4295水平檢測 膠質瘤細胞轉染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組miR-4295水平(0.45±0.03)顯著低于control組(1.00±0.09)、anti-NC組(1.01±0.12，P<0.05)。表明miR-4295抑制劑抑制膠質瘤細胞中miR-4295表達。

2.2細胞增殖能力及凋亡率檢測 膠質瘤細胞轉染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組細胞OD值均顯著低于control組及anti-NC組 ，而凋亡率顯著高于control組、anti-NC組(均P<0.05)。表明下調miR-4295抑制膠質瘤細胞增殖并誘導凋亡。見圖1，表1。

圖1 流式細胞術測定miR-4295抑制劑轉染后膠質瘤細胞凋亡變化

表1 miR-4295抑制劑轉染后膠質瘤細胞增殖和凋亡變化

2.3細胞侵襲和遷移能力檢測 膠質瘤細胞轉染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組遷移和侵襲數目均顯著低于control組及anti-NC組(均P<0.05),見表2。表明下調miR-4295抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲。

表2 miR-4295抑制劑轉染后膠質瘤細胞侵襲和遷移能力變化個)

2.4生物信息學軟件預測 miR-4295與CDKN1A的3′UTR端有互補結合位點，熒光素酶報告系統鑒定結果發現CDKN1A為miR-4295的靶基因，見圖2。miR-4295 mimics組WT顯著低于mimics control組(P<0.05)，見表3。表明miR-4295靶向調控CDKN1A。

圖2 生物信息學軟件預測miR-4295與CDKN1A的3′UTR端結合位點

表3 熒光素酶報告系統鑒定靶向關系

2.5CDKN1A蛋白檢測 膠質瘤細胞轉染 miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組CDKN1A蛋白水平(0.85±0.09)顯著高于control組(0.51±0.06)及anti-NC組(0.49±0.06，均P<0.05),見圖3。表明下調miR-4295促進膠質瘤細胞中CDKN1A蛋白表達。

圖3 Western印跡檢測miR-4295抑制劑轉染后膠質瘤細胞中CDKN1A蛋白表達

2.6CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉染后細胞活力及CDKN1A蛋白檢測 anti-miR-4295+si-CDKN1A組CDKN1A蛋白水平、凋亡率顯著低于anti-miR-4295+si-NC組，而細胞OD值、侵襲和遷移數目均顯著高于antimiR-4295+si-NC組(均P<0.05)，見圖4、圖5、表4。表明CDKN1A siRNA逆轉下調miR-4295對膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。

1～2：anti-miR-4295+si-NC組,anti-miR-4295+si-CDKN1A組圖4 Western印跡檢測CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉染后的膠質瘤細胞中CDKN1A蛋白表達

圖5 流式細胞術檢測CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉染后的膠質瘤細胞凋亡變化

3 討 論

miRNA是一類在人體組織中廣泛存在的非編碼RNA，有很多生物學作用，在組織修復、細胞生長、胚胎發育等生理過程中扮演關鍵角色〔7〕。miRNA還與人類疾病的發生有關，其可通過調控心肌細胞、血管內皮細胞等多種細胞的生長、凋亡影響心血管系統疾病的發生，miRNA還與關節炎、糖尿病等疾病關〔8，9〕。miRNA異常表達與腫瘤細胞的生長、轉移、凋亡有關，miRNA也是目前基因靶向治療關注的熱點〔10〕。本實驗提示下調miR-4295有抵抗膠質瘤惡性生長的作用，靶向miR-4295可能是抑制膠質瘤進展的途徑。miR-4295可促進鼻咽癌、胰腺導管癌等細胞的惡性增殖，miR-4295在腫瘤組織中高表達〔5,11,12〕。本實驗提示miR-4295在膠質瘤進展中也扮演類似癌基因的作用。

腫瘤細胞的侵襲和遷移是腫瘤轉移和浸潤的基礎，而腫瘤轉移和浸潤是腫瘤患者死亡的重要原因〔13,14〕。miR-4295參與調控腫瘤轉移過程，在甲狀腺未分化癌和膀胱癌等腫瘤中已經證實miR-4295有促進腫瘤細胞侵襲和遷移的作用〔5,11,12〕。本實驗提示下調miR-4295能抵抗膠質瘤轉移和浸潤，miR-4295在膠質瘤轉移中也可能扮演抑制作用。

miRNA參與多種病理及生理進程與靶向調控基因的表達有關，并且同一個miRNA在不同的組織或病理過程中可能同時有多個不同的靶基因〔15～17〕。目前對于miR-4295的研究顯示，miR-4295作用機制與PTEN、BTG1等靶基因的表達有關〔4,5〕。本實驗發現miR-4295能靶向負調控膠質瘤細胞中CDKN1A的表達。CDKN1A是一個與細胞生長有關的調節因子，其能降低細胞生長速度。CDKN1A與腫瘤發生有關，其在腫瘤進展中發揮抑癌基因的作用，CDKN1A過表達可抑制膠質瘤細胞的生長〔18～20〕。本實驗結果提示下調CDKN1A可靶向負調控CDKN1A表達抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移和誘導凋亡。

綜上，miR-4295在膠質瘤進展和轉移中可能發揮促進作用，靶向下調miR-4295表達可能是膠質瘤治療的有效途徑，下調miR-4295能夠在體外降低膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并且可以誘導細胞凋亡發生，作用機制與靶向負調控CDKN1A的表達有關。miR-4295在膠質瘤發生和轉移中的具體機制還需要在以后的實驗中深入探討。