MMP-2在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用

孫靜 盛天強 姚鵬 孫文華 詹芬芳 陳勇 胡衍輝 余樹春 徐國海

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科 江西省麻醉學(xué)重點實驗室，江西 南昌 330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3湖北省孝感市中心醫(yī)院；4江西省高安市婦幼保健院)

缺血缺氧性腦血管疾病迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。研究表明，炎性機制是腦缺血再灌注損傷的最重要機制之一，腦缺血損傷誘導(dǎo)炎性細胞激活和大量炎性細胞因子釋放在腦缺血損傷過程中有重要作用〔1，2〕。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，研究表明，MMP-2在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后表達明顯升高，而通過使用MMP-2抑制劑(TIMP-2)可有效緩解缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心功能惡化〔3，4〕，但MMP-2參與缺血性腦血管病的確切機制尚不清楚。本研究探討MMP-2在腦缺血缺氧炎性反應(yīng)中的作用及調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1動物選擇及分組 健康雄性SD大鼠(購于南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)部)48只，4～6周齡，體重200～220 g。采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、局灶性腦缺血/再灌注損傷模型組(IR組)、TIMP-2組(T組)。IR組和T組采用線栓法進行大鼠腦缺血2 h再灌注制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，T組于模型制備前給予TIMP-2，Sham組僅分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，不置入線栓。

1.2模型建立 參照文獻〔5〕方法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。腹腔注射10%水合氯醛(2 mg/kg)進行麻醉，將大鼠仰臥位固定于動物手術(shù)臺上。碘伏消毒頸部皮膚并鋪無菌洞巾，取正中切口切開皮膚筋膜，鈍性分離肌肉至頸動脈鞘，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈及頸外動脈。隨后在頸總動脈分叉處用眼科剪剪開小口，將線栓(直徑 0.26 mm，長5 cm)置入右側(cè)頸內(nèi)動脈約2 cm，生理鹽水沖洗后逐層縫合，2 h后提拉線栓至頸總動脈內(nèi)。術(shù)中用烤燈照射維持大鼠體溫(36±1)℃，術(shù)后肌注青霉素10萬U/只。

1.3神經(jīng)功能缺失體征(NDS)評分 參照Longa等〔6〕評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常者，計0分；不能完全伸展對側(cè)前爪，計1分；動物爬行時出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈追尾現(xiàn)象，計2分；身體向偏癱側(cè)傾倒者，計3分；不能自發(fā)行走，意識喪失者，計4分。

1.4血腦屏障通透性檢測 使用伊文思藍(EB)注射法評價血腦屏障通透性。使用10%水合氯醛麻醉大鼠。隨后經(jīng)股靜脈注入2% EB溶液，2 h后打開胸腔，通過升主動脈灌注生理鹽水200 ml，斷頭取腦，用冰生理鹽水沖洗。擦干后稱重，加入2 ml 50%三氯乙酸溶液勻漿，4℃ 1 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積無水乙醇。使用分光光度計檢測620 nm處吸光度OD值，并計算腦組織中EB含量。

1.5MMP-2蛋白表達的測定 采用Western印跡法進行檢測。取大鼠腦組織，液氮研磨后提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，標(biāo)記后-20℃保存。各取蛋白樣品上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，80 V恒壓電泳至指示帶分離，隨后250 mA恒流轉(zhuǎn)移120 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入MMP-2一抗(稀釋度1∶1 000，Abcam公司，美國)、β-actin一抗(稀釋度1∶1 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司)4℃孵育過夜。次日TBST緩沖液漂洗后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶6 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影，Image Lab 拍照分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白相對表達水平。

1.6熒光定量PCR檢測MMP-2基因mRNA表達水平 取大鼠腦組織，液氮研磨后制備腦組織勻漿，Trizol法提取腦組織總RNA，測定RNA濃度及純度，-80℃保存。從GenBank數(shù)據(jù)庫查找MMP-2、β-actin引物序列(由華大基因合成)如下：MMP-2：上游引物5′-CTCTTCCATCCAACATGGATAGCTG-3′，下游引物5′-ACTCCAACTGTGAAGATCCGCTGA-3′。β-actin：上游引物5′-ATATCGCTGCGCTGGTC-3′，下游引物5′-ACCCATTCCCACCATCACAC-3′。反應(yīng)條件：42℃孵育15 min，85℃加熱5 s；94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，使用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達水平。

1.7微板法測定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及髓過氧化酶(MPO)含量 斷頭取腦，冰生理鹽水沖洗后加入組織提取液后使用勻漿器充分勻漿，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明步驟進行上樣，使用酶標(biāo)儀檢測光密度值，并按說明書公式計算SOD、MDA及MPO含量。

1.8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β含量 取大鼠腦組織，液氮研磨后制備腦組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清。按照說明書步驟加入標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測液，使用酶標(biāo)儀上機檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清TNF-α、IL-1β含量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組各時間點NDS評分比較 Sham組未見神經(jīng)功能缺失癥狀。與Sham組比較，IR組和T組再灌注4、8、24、72 h(T1～T4)時NDS評分顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時NDS評分顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 3組各時點NDS評分比較分,n=4)

2.23組各時間點腦組織EB含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時腦組織EB含量顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時腦組織EB含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 3組各時點腦組織EB含量比較

2.33組各時間點腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達均顯著降低(均P<0.05)，見表3。

2.43組各時間點腦組織MPA、SOD、MPO含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時腦組織MDA及MPO含量顯著升高，SOD含量顯著降低(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時腦組織MDA及MPO含量顯著降低，SOD含量顯著升高(P<0.05)，見表4。

2.53組各時點腦組織TNF-α及IL-1β含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時腦組織TNF-α及IL-1β含量顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時腦組織TNF-α及IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，見表5。

3 討 論

線栓法是制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型的常用方法之一，其操作簡單、重復(fù)性好且可靈活調(diào)整缺血及再灌注的處理時間。本研究顯示，IR組大鼠在采用線栓法進行腦缺血2 h再灌注后出現(xiàn)左前肢不能伸展、爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈等行為，NDS評分及血腦屏障通透性明顯升高，腦組織炎性因子水平及氧化應(yīng)激水平表達明顯升高，表明模型制備成功。

研究表明，腦缺血再灌注損傷的病理生理過程主要包括能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基損傷、炎性細胞因子損傷及一氧化氮毒性作用等病理機制〔7～9〕，除缺氧和能量代謝衰竭外，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣效應(yīng)是導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元凋亡的重要機制。本研究提示大鼠在腦缺血再灌注損傷可出現(xiàn)血腦屏障損傷、大量炎性因子釋放及氧化應(yīng)激損傷，從而出現(xiàn)腦損傷。

血腦屏障作為機體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在腦缺血再灌注損傷中占有重要地位。血腦屏障損傷是腦缺血的重要表現(xiàn)，而血腦屏障損傷又將進一步加重腦損傷，引起腦水腫、氧化應(yīng)激損傷及炎性反應(yīng)等，甚至導(dǎo)致腦死亡〔10〕。MMPs在正常腦組織中不表達或低表達，當(dāng)腦缺血再灌注時，MMPs激活導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，引起血管源性腦水腫及繼發(fā)性神經(jīng)炎性反應(yīng)，并導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷〔11〕。血管基底膜與細胞外基質(zhì)是維持血腦屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而MMPs是一類能降解細胞外基質(zhì)成分的蛋白水解酶，其中MMP-2為明膠酶，是MMPs家族中的主要成員，在正常的腦組織中呈低水平表達，并與TIMP-2共同形成隨時間變化的動態(tài)平衡，維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后，MMPs與TIMPs平衡失調(diào)，MMP-2的表達增加，MMP-2通過降解細胞外基質(zhì)導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加，促進炎性反應(yīng)的發(fā)生，在腦缺血再灌注和出血轉(zhuǎn)化過程中扮演重要的角色〔12，13〕。本研究參照Szychowski等〔14〕研究并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果選擇TIMP-2的給藥方式及計量，結(jié)果提示TIMP-2可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機制與其減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷、降低炎性反應(yīng)、改善血腦屏障的通透性及下調(diào)MMP-2表達有關(guān)。TIMPs是MMPs特異性抑制因子，其通過與酶和酶原的催化位點結(jié)合，使酶失活或阻止酶的活性。TIMP-2是一種可溶性分泌蛋白，其可選擇性抑制MMP-2，對抗MMP-2的活性，減輕腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)〔15〕。

綜上，TIMP-2可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機制與下調(diào)MMP-2表達有關(guān)。