長鏈非編碼RNA LINC00467靶向miR-1247-5p調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

李豪 姬發(fā)祥 徐曉寧 馬金華 沈存芳 李進(jìn)章 王麗娟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810000)

肝癌發(fā)病率及死亡率較高，臨床治療過程中主要采用手術(shù)治療，但術(shù)后患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率逐年升高〔1〕。因而探討肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用機(jī)制是提高肝癌治療效果的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與癌癥、心血管疾病等生理病理過程并可發(fā)揮重要調(diào)控作用〔2〕。lncRNA LINC00467在神經(jīng)母細(xì)胞瘤及結(jié)腸癌中高表達(dá)，并可促進(jìn)結(jié)腸癌的遷移和侵襲〔3，4〕。LINC00467還可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和血管生成，且與腫瘤大小和血管侵犯等因素密切相關(guān)〔5〕。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測LINC00467可吸附微小RNA-1247-5p(microRNA-1247-5p，miR-1247-5p)進(jìn)而抑制其表達(dá)，研究顯示miR-1247在胰腺癌組織中下調(diào)表達(dá)，miR-1247過表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖〔6〕。miR-1247在胃癌組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，上調(diào)miR-1247表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖及遷移〔7〕。近來研究顯示miR-1247-5p可在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用，并可能通過調(diào)控Wnt3表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖及遷移〔8〕。但LINC00467在肝癌中的表達(dá)研究及其是否通過調(diào)控miR-1247-5p的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲目前尚未可知。本研究通過檢測LINC00467在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，初步探究LINC00467對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人不同肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721、BEL-7402及正常肝細(xì)胞株L02均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。DMEM、胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Transwell小室與基質(zhì)膠均購自美國Corning公司；LINC00467過表達(dá)質(zhì)粒購自吉?jiǎng)P公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；siRNA、miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p抑制劑及其各自陰性對(duì)照均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、miScriptⅡRTKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)試劑盒均購自美國Promega公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 不同肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基含有100 ml/L胎牛血清，放置在溫度為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱，將生長良好的HepG2細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞板，用對(duì)照序列(si-NC)與si-LINC00467進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別為si-NC組、si-LINC00467組；用miR-NC與miR-1247-5p mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別為miR-NC組、miR-1247-5p組；用LINC00467過表達(dá)質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別為pcDNA-LINC00467組、pcDNA組；用anti-miR-1247-5p與anti-miR-NC轉(zhuǎn)染si-LINC00467組細(xì)胞，分別為si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組、si-LINC00467+anti-miR-NC組。所有操作需嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中 LINC00467、miR-1247-5p表達(dá)水平 LINC00467、miR-1247-5p相對(duì)表達(dá)量檢測均需采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，所有引物序列由華大基因生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。qRT-PCR條件為95℃ 5 min，循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)數(shù)為40次。收集各孔閾值(Ct)，LINC00467、miR-1247-5p均以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00467、miR-1247-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 按照1.2分別處理細(xì)胞后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，30 min后12 000 r/min離心10 min(溫度為4℃)，收集上清并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳反應(yīng)分為積層膠(80 V 40 min)與分離膠(120 V 1.5 h)，電泳結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉1 h后分別加入各蛋白一抗(稀釋比1∶500)，置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，TBST洗膜后分別加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影并曝光，放入凝膠成像分析系統(tǒng)并應(yīng)用Scion Image軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.5熒光素酶報(bào)告基因檢測 通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-1247-5p在LINC00467上的結(jié)合位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增此結(jié)合位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段插入pMIR-REPORT載體構(gòu)建LINC00467野生型質(zhì)粒(WT-LINC00467)；采用基因突變技術(shù)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建LINC00467突變型質(zhì)粒( MUT-LINC00467)。分別將WT-LINC00467、MUT-LINC00467與miR-1247-5p mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.6MTT檢測細(xì)胞增殖 將各組對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×103個(gè)細(xì)胞/孔)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24、48、72 h向每孔分別加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液10 μl，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩充分混勻后置于酶標(biāo)儀檢測各組在波長為490 nm處的光密度(OD)值。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲 取各組對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，不含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(密度為5×104)，取200 μl細(xì)胞懸浮液加入Transwell小室的上室，取500 μl含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄上層培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用多聚甲醛(4%)固定20 min，用棉簽除去上層液體，結(jié)晶紫染色，10 min后用PBS洗滌，置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：按照1∶8比例用不含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上室，按80 μl/孔密度包被Transwell小室底部膜，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00467和miR-1247-5p在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá) 不同肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402中LINC00467相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞株L02(P<0.05)，而miR-1247-5p相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 LINC00467和miR-1247-5p在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

肝癌HepG2細(xì)胞中LINC00467相對(duì)表達(dá)量最高，miR-1247-5p相對(duì)表達(dá)量最低，因此后續(xù)研究中將以肝癌HepG2細(xì)胞為主要研究材料。

2.2抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 Western印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-LINC00467組LINC00467相對(duì)表達(dá)量明顯低于si-NC組(P<0.05)，48 h與72 h時(shí)HepG2細(xì)胞OD值明顯低于si-NC組(P<0.05)，見表2。si-LINC00467組HepG2細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)較si-NC組顯著下調(diào)(P<0.05)，而p21與p27蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖1，表3。

表2 抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制LINC00467表達(dá)后，HepG2細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)較si-NC組明顯降低(P<0.05)，Western印跡檢測結(jié)果顯示，si-LINC00467組HepG2細(xì)胞中MMP-2、 MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)相較于si-NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2、圖3、表4。

圖2 遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 肝癌HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

2.4miR-1247-5p過表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測顯示，miR-1247-5p組miR-1247-5p表達(dá)水平明顯高于miR-NC組(P<0.05)。MTT檢測結(jié)果顯示miR-1247-5p組48、72 h HepG2細(xì)胞OD值明顯降低(P<0.05)；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-1247-5p組HepG2細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)均明顯降低(P<0.05)；Western印跡顯示miR-1247-5p組HepG2細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見表5，表6，圖4。

表6 miR-1247-5p過表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 miR-1247-5p過表達(dá)的增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5LINC00467靶向調(diào)控miR-1247-5p的表達(dá) 通過生物信息預(yù)測顯示LINC00467上存在miR-1247-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5)，采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00467與miR-1247-5p的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示miR-1247-5p mimic可顯著降低WT-LINC00467熒光素酶活性(P<0.05)，結(jié)合位點(diǎn)突變后miR-1247-5p mimic對(duì)LINC00467質(zhì)粒熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表7。Western印跡檢測結(jié)果顯示，相較于si-NC組(1.01±0.09)，si-LINC00467組miR-1247-5p表達(dá)水平(3.16±0.28)明顯升高(P<0.05)；相較于pcDNA組(1.03±0.08)，pcDNA-LINC00467組miR-1247-5p表達(dá)水平(0.34±0.04)明顯降低(P<0.05)。

2.6抑制miR-1247-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 與si-LINC00467+anti-miR-NC組相比，qRT-PCR顯示si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組HepG2細(xì)胞中miR-1247-5p相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；MTT檢測顯示HepG2細(xì)胞48、72 h OD值、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.05)；Western印跡檢測顯示HepG2細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖6，表8，表9。

圖5 LINC00467的序列中含有與miR-1247-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：si-NC組、si-LINC00467組、si-LINC00467+anti-miR-NC組、si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組圖6 抑制miR-1247-5p的增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

肝癌具有惡性程度高等特點(diǎn)，由于肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制尚未完全闡明導(dǎo)致肝癌進(jìn)展快及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高〔9〕。研究顯示肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA發(fā)揮重要作用〔10〕。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，從分子水平上尋找新型分子標(biāo)志物及肝癌治療靶點(diǎn)成為新方向。

LINC00467在結(jié)直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，并可能作為臨床早期診斷及評(píng)估患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志物〔11～13〕。然而，LINC00467在肝癌中的作用研究鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果說明LINC00467表達(dá)水平升高可能是誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的原因之一，提示LINC00467可能通過調(diào)控某些基因轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)而發(fā)揮促癌作用。研究表明LINC00467在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵移轉(zhuǎn)移，沉默LINC00467表達(dá)可抑制癌細(xì)胞惡性增殖并可為靶向治療非小細(xì)胞肺癌提供潛在靶點(diǎn)〔14,15〕。本研究結(jié)果表明抑制LINC00467表達(dá)后肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1蛋白表達(dá)明顯降低，而p21與p27蛋白表達(dá)明顯升高，其中CyclinD1能夠與細(xì)胞周期依賴性蛋白結(jié)合并促使細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，p21與p27可抑制CyclinD1與細(xì)胞周期依賴性蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖〔16〕。提示沉默LINC00467表達(dá)可能通過上調(diào)p21、p27蛋白表達(dá)并抑制CyclinD1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖。Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的物質(zhì)基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)降解，MMP-2激活后可促進(jìn)MMP-9、MMP-14活化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲過程〔17〕。說明抑制LINC00467表達(dá)可能通過抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14活化進(jìn)而降低肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。提示肝癌細(xì)胞中LINC00467表達(dá)水平升高可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲蛋白表達(dá)而發(fā)揮癌基因作用。

原發(fā)性肝癌患者血清中miR-1247-5p表達(dá)水平顯著降低，并可能作為肝癌早期診斷的重要指標(biāo)〔18〕。乳腺癌患者組織及細(xì)胞中miR-1247-5p均呈低表達(dá)并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，上調(diào)miR-1247-5p表達(dá)可能通過調(diào)控DVL1/Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長，同時(shí)miR-1247-5p還與去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔19,20〕。本研究結(jié)果提示上調(diào)miR-1247-5p 表達(dá)可通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)并上調(diào) p21蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示LINC00467可靶向調(diào)控miR-1247-5p表達(dá)即LINC00467可通過競爭性吸附miR-1247-5p從而促使其表達(dá)水平降低。為了驗(yàn)證LINC00467是否通過負(fù)向調(diào)節(jié)miR-1247-5p而發(fā)揮作用，本研究將沉默miR-1247-5p表達(dá)，將其與LINC00467 siRNA共同轉(zhuǎn)染入肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果提示抑制miR-1247-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00467表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用。

綜上，肝癌細(xì)胞中LINC00467高表達(dá)，miR-1247-5p低表達(dá)，LINC00467可通過抑制miR-1247-5p表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，可為后續(xù)深入研究肝癌發(fā)生及發(fā)展的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)，并可為臨床診斷及治療肝癌提供有效靶點(diǎn)。然而，關(guān)于LINC00467競爭性吸附miR-1247-5p并抑制其表達(dá)后又是如何調(diào)控疾病進(jìn)展相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)仍需深入研究。