中藥萎胃康對慢性萎縮性胃炎大鼠wnt3α、wnt5α、β-catenin蛋白表達的影響

呂俊慧 于佳寧 陳露 宋漢娜 林海燕

(濱州醫學院 1中西醫結合學院，山東 煙臺 264003；2煙臺附屬醫院兩腺外科)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種常見的消化系統疾病，其特點是胃黏膜萎縮變化，內分泌腺減少或消失。其病程長，難以治愈，通常伴或不伴纖維替換性腸上皮化生和(或)假性幽門上皮化生〔1〕。臨床癥狀是胃部飽脹感、胃痛、反酸、胃灼熱，尤其飯后明顯。長期反復發作，極易導致癌變，嚴重影響人們的生活質量。胃癌對于消化道黏膜的傷害是不可逆的，且易轉移，其治療過程艱難；但CAG是可逆的，確診和治愈也更為簡便。所以對于CAG癌前病變的研究尤為重要。目前，CAG的病機尚不清楚，亦沒有療效較好的藥物。臨床上西醫主要是對癥治療，但是治標不治本。而中醫藥應用時間久，累積了豐富的案例經驗，在臨床中有獨特的優勢。目前，大多中醫認為CAG的病機是本虛標實，本研究從脾胃虛證，瘀血阻絡的方向出發，以益氣養陰，活血通絡法為主組方，對萎胃康進行研究。萎胃康對CAG有較好的治療作用，且優于維酶素〔2〕。研究發現該藥能有效改善CAG大鼠胃黏膜腺體萎縮，改善胃腸激素對胃功能的調節作用，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，以防止癌變〔3〕。本研究復制CAG大鼠模型，通過檢測各組大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α及β-catenin的含量，探討萎胃康顆粒治療CAG的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物健康，雄性，SD大鼠60只，體重(120±20)g，山東濟南朋悅繁育有限公司提供。單位許可證編號：SYXK(魯)20140007。藥品與試劑萎胃康顆粒(西洋參、白術、白芍、延胡索、三七和熊膽等)由濱州醫學院附屬醫院藥劑科完成鑒定及制備。水楊酸鈉(批號：20181107)購自北京Solarbio；維酶素片(批號：20170215)購自新鄉恒久遠藥業有限公司；兔抗β-catenin(批號:00051773)購自美國proteintech公司；兔抗wnt3α(批號:9G122B)、兔抗wnt5α(批號:ZP480BP80)及兔Ig-G免疫組化試劑盒(批號:13G24C26G0922)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法 動物造模、分組隨機從60只雄性SD大鼠中抽取10只作為正常組，其他作為造模組。按照傳統方式復制模型〔4〕：用2%的水楊酸鈉溶液，2 ml/d灌胃，灌胃前后1 h禁食禁水，前3 w正常飲食，后3 w間日足量飲食，進行6 w。然后隨機從正常組抽取2只，造模組抽取5只，肉眼觀察，模型組比正常組大鼠相比，體型瘦小，毛色粗糙晦暗。HE染色，光鏡下觀察到胃黏膜腺體萎縮減少，排列松散，有炎性細胞浸潤。確認造模成功后，將剩余45只模型大鼠隨機分為萎胃康高〔3.00 g/(kg·d)〕、中〔1.50 g/(kg·d)〕、低〔0.75 g/(kg·d)〕劑量組、維酶素組〔0.3 g/(kg·d)〕、模型組，每組9只，模型組和正常組均灌生理鹽水，1次/d，連續灌胃30 d。組織形態學觀察30 d后，禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)，麻醉后固定解剖，把整個胃取出，肉眼觀察整個胃部的變化，然后順著胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗。留取胃竇部，剪為合適的大小，用中性甲醛固定液(10%)固定12 h以上。流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，然后以4 μm的厚度進行連續切片4張，1張做蘇木素-伊紅(HE)染色，其余3張用于免疫組化檢測。指標檢測采用免疫組化法(IHC)，嚴格按照wnt3α、wnt5α和β-catenin抗體試劑盒說明書進行實驗，二氨基聯苯胺(DAB)染色后抗體在組織中的表達呈黃褐色，在高倍鏡下隨機取5個視野拍照后，用Image-Pro Plus6.0圖片分析軟件測積分光密度(IOD)，5個視野的平均IOD即為該大鼠胃組織相應指標的測定值。

1.3統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1光鏡下各組大鼠胃黏膜的病理變化 正常組胃黏膜腺體排列緊密有序，無或有少量炎性細胞。模型組胃黏膜變薄，腺體萎縮減少，排列松散，有炎性細胞浸潤。萎胃康高劑量治療30 d后，胃黏膜腺體萎縮情況緩解，排列稍微整齊，腺體數目增多，接近正常胃黏膜。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理情況(HE，×20)

2.2各組大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的表達 與正常組比較，模型組wnt3α、wnt5α和β-catenin表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與模型組比較，各給藥組wnt3α、wnt5α和β-catenin表達均顯著下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)。說明萎胃康和維酶素都能降低胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的蛋白表達量，且萎胃康高劑量組的治療效果比其他給藥組更顯著(P<0.05)。見表1、圖2～4。

圖2 各組大鼠胃黏膜wnt3α蛋白的表達(DAB,×40)

圖3 各組大鼠胃黏膜wnt5α蛋白的表達(DAB,×40)

圖4 各組大鼠胃黏膜β-catenin蛋白的表達(DAB，×40)

3 討 論

CAG屬于中醫學 “胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。目前，大多數中醫學者認為，CAG的病機為本虛標實，本虛是氣陰兩虛，標實是瘀血阻絡，兩者之間關系密切，氣陰不足，動力不足，運化失常，則脾胃腐熟水谷的能力下降；推動無力，血流不暢，則形成血瘀；瘀血阻絡，則氣血通行不暢，運化失常，導致脾氣胃氣升降失司；兩者互成因果，互相影響。有瘀血阻滯脾胃，氣血不通暢，不通則痛，就出現胃脘痛；脾胃氣行不暢，氣機升降失常則痞滿；胃氣虛，陰液不足，胃失于濡養，則嘈雜。萎胃康顆粒由西洋參、白術、白芍、延胡索、三七和熊膽等藥物組成，有補氣健脾、養陰益胃、活血化瘀的作用。其中，西洋參是君藥，能益氣生津、滋養胃陰，具有促進免疫力的功能。白術補脾益氣，具有增強免疫的作用，白芍滋陰，對細胞免疫功能有正向作用，能抑制急性炎癥水腫，共為臣藥。延胡索用于全身各部氣滯血瘀，能行氣活血，散瘀止痛，三七活血化瘀，熊膽清熱利濕，三者是為佐使藥；另外，延胡索還能起到抗潰瘍的作用，三七具有抗炎的作用，熊膽能抑菌抗炎助消化。

CAG作為胃癌的癌前狀態，其發展演變影響人們的健康和生活，CAG的研究對于降低胃癌的發生有重要意義。研究發現，wnt信號通路的異常激活在胃癌中是一個普遍事件〔5,6〕。wnt蛋白家族通常是激活是Wnt信號通路的啟動因子〔7〕。經典的wnt信號通路主要與β-catenin有關：β-catenin是一種多功能的蛋白質，能夠影響細胞的生存、凋亡。正常情況下，β-連環蛋白發生磷酸化，不會積聚在細胞內〔8〕。當wnt信號進入細胞將Dsh激活后，活化的Dsh就會抑制腫瘤抑制基因(APC)、軸蛋白(Axin)和糖原合成酶激酶3β形成的復合物活性，因此，β-連環蛋白不能被磷酸化降解，大量累積在細胞內，激活TCF/LEF并調節下游靶基因的表達〔9〕。由此可見，wnt信號通路的激活與β-連環蛋白在細胞質累積的量有關，β-連環蛋白是胃癌病變中一個重要的蛋白指標。wnt3α目前研究比較多，普遍認為它能夠激活wnt經典信號通路。研究發現，wnt3α表達量的上調在激活wnt信號通路導致胃癌的發生起到重要的作用，wnt3α的高表達會導致β-catenin在細胞內的大量積累，從而激活下游靶基因〔10〕。說明wnt3α、β-catenin在胃癌wnt信號通路激活中起雙重作用，甚至是疊加作用。蔡園園〔11〕用免疫組化法檢測發現，在CAG癌前病變的發展過程中，wnt3α、β-catenin 的表達量隨著疾病的發展而增加。wnt5α是非經典的wnt信號通路，幾乎在全身各部的腫瘤中都能找到它的參與。穆標等〔12〕用免疫組化法研究發現，從淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生到胃癌，wnt5α的表達量是一個上調的過程，表明wnt5α參加了胃癌的發生過程，是關鍵的致癌基因。研究發現，wnt5α具有雙重作用，在不同的非經典信號通路下，wnt5α能夠降低β-連環蛋白的積累，而在這個過程中，wnt5α的濃度并沒有變化；并且wnt5α可以通過與wnt3a競爭性與相關受體結合，抑制信號通路激活；或者wnt5α直接激活相關蛋白，促進β-catenin的降解，從而抑制腫瘤的發生，當wnt5α與特定受體結合時，它可以穩定β-catenin，上調其表達，激活經典信號傳導途徑，促使癌癥發生〔13〕。由此可見wnt5α的表達與腫瘤的類型、不同的信號通路以及與wnt5a結合的受體種類有關，并且三者之間關系復雜。