老年宮頸癌HPV感染亞型及抑癌基因p53、p16、pRb表達

來正偉 王華斌 陳建亮 溫達靜 (杭州市蕭山區第一人民醫院婦科，浙江 杭州 311200)

宮頸癌(CC)作為婦產科常見惡性腫瘤，隨著宮頸細胞學篩查的應用，該病發病率、死亡率有一定降低，但流行病學調查顯示，CC發病現愈發趨于年輕化〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發CC的主要原因，研究顯示，HPV感染過程分為潛伏期、亞臨床期、癥狀期、腫瘤期4個階段，而不同HPV亞型感染過程進展各異，其中高危型HPV持續感染可能會加速CC進展，增加預后風險〔2,3〕。因此，明確老年CC患者HPV感染亞型，對指導早期干預意義重大。p53、p16、pRb是近年來腫瘤組織中發現的抑癌基因，研究發現，上述基因可紊亂腫瘤細胞周期，降低蛋白激酶活性，促進腫瘤細胞凋亡，預防腫瘤細胞增殖〔4〕。陳麗等〔5〕研究顯示，尖銳濕疣HPV16/18感染患者p53、p16、pRb表達低于HPV16/18陰性患者，且p53、p16、pRb表達可預測癌變風險。由此猜測，p53、p16、pRb表達可能與老年CC患者HPV感染亞型存在一定關系，但目前相關研究較少。鑒于此，本研究通過觀察老年CC組織中抑癌基因p53、p16、pRb表達情況，分析抑癌基因p53、p16、pRb表達與老年CC患者HPV感染亞型的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧收集杭州市蕭山區第一人民醫院2005年12月至2018年9月經病理組織確診并完成治療、隨訪的140例老年HPV感染CC患者癌組織標本。納入標準：患者均符合《宮頸癌及癌前病變病理診斷規范》〔6〕中CC相關診斷標準，且經病理檢查證實；均經細胞病理學檢查提示HPV感染。(2)排除標準：合并感染性疾病；合并其他惡性腫瘤；伴心肝腎等重要臟器相關疾病；合并其他宮頸疾病。140例患者年齡62～77歲，平均(69.50±2.34)歲；體重指數(BMI)17.6～24.9 kg/m2，平均(21.22±1.04)kg/m2；病理類型：鱗癌83例，腺癌32例，腺鱗癌25例；臨床分期：Ib1期21例，Ib2期53例，Ⅱa期66例；分化程度：低分化32例，中分化65例，高分化43例。本研究的實施符合倫理委員會相關標準，患者標本組織、臨床資料等均完整。

1.2方法

1.2.1HPV感染亞型檢測及分組 將裂解、凍存的細胞液置于室溫下溶解后，采用HPV分型檢測試劑盒分離、提取標本組織DNA，并對標本DNA進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增及雜交，采用HPV擴增分型檢測試劑盒測定HPV分型，主要包括高危型(HPV16、18、31、35、45等)、低危型(HPV6、11、30、39等)兩種；將高危型HPV感染患者納入高危型組，反之則納入低危型組。

1.2.2抑癌基因p53、p16、pRb檢測 取患者病理組織標本，采用熒光定量PCR法測定抑癌基因p53、p16、pRb表達；PCR法檢測：將裂解、凍存的細胞液置于室溫下溶解后，先對標本進行兩項分離，提取標本RNA并置于水箱中，沉淀、清洗后將干燥的RNA溶解并獲取對應溶液，置于-80℃超低溫冰箱內儲存；采用紫外吸收法檢測RNA溶液純度，然后合成cDNA樣品，對合成樣本進行逆轉錄反應，反應體系分為包括緩沖液2 μl、dNTP 0.1 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水5 μl、MMLV 0.5 μl、RNA模板2 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl；先繪制待檢抑癌基因PCR標準曲線，然后進行定量PCR檢測；擴增反應條件為：先于93℃環境下變性2 min，然后分別于93℃、55℃、72℃環境下變性1 min，設定40個循環，最后在72℃環境下延伸7 min；根據目標基因選取對應引物序列，取正常宮頸組織為對照，并設定各抑癌基因表達量為100，測定CC組織中p53、p16、pRb表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗、Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1老年CC患者HPV感染亞型情況 140例老年CC患者中128例(91.43%)高危型HPV感染；其中HPV16感染64例(50.00%)、HPV18感染43例(33.59%)；HPV31感染12例(9.37%)；其他9例(7.04%)。

2.2不同 HPV感染亞型老年CC患者相關基線資料比較 高危型HPV感染組抑癌基因p53、p16、pRb表達均明顯低于低危型組(P<0.05)；組間其他基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響分析 將抑癌基因p53、p16、pRb作為自變量(均為連續變量)，將老年CC患者HPV感染亞型作為因變量(1=高危型，0=低危型)，經二元Logistic回歸分析檢驗結果顯示，抑癌基因p53、p16、pRb低表達均可能是老年CC患者高危型HPV感染的影響因素(P<0.05)。見表2。Logistic多元回歸分析：將老年CC患者HPV感染亞型作為因變量(1=高危型，0=低危型)，同時納入年齡、BMI等基線資料，建立Logistic多元回歸模型，在校正年齡、BMI等帶來的影響后，結果顯示，抑癌基因p53、p16、pRb低表達均是老年CC患者高危型HPV感染的影響因子(OR>1，P<0.05)。見表3。

表2 抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響二元Logistic回歸分析結果

表3 抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響Logistic多元回歸分析結果

3 討 論

目前已經發現的HPV亞型有200多種，其中有30多種HPV亞型與CC發生、發展存在一定關系，但研究顯示，不同亞型HPV致病力存在差異〔7〕。據報道，持續性高危型HPV感染不僅會使宮頸上皮細胞發生癌前病變，誘發CC，還將加速腫瘤細胞增殖，促進腫瘤轉移〔8〕。因此，明確老年CC患者HPV感染亞型，對指導臨床干預尤為必要。

隨著病理組織學的深入研究，有報道指出，CC患者HPV感染亞型與癌基因表達密切相關〔9〕。p53是生物體內重要抑癌基因，主要分為突變型、野生型2種，其中突變型基因有致癌作用，而野生型則具有抑癌作用〔10〕。野生型p53可監視細胞基因結構情況，及時誘導異常DNA細胞凋亡，繼而清除有癌變傾向的細胞，發揮抑癌作用〔11〕。相關研究顯示，野生型p53基因丟失會導致宮頸上皮細胞異常分化、增殖，誘發上皮細胞癌變，同時HPV感染后病毒DNA中E6會結合p53，導致野生型p53活性降低，繼而增強HPV致病力，促進疾病發展〔12〕。G1/S是真核細胞分裂、增殖主要細胞周期調控點，該點有多條調控途徑，可維持細胞正常分裂及增殖，其中pRb是G1/S調控中心環節〔13〕。研究顯示，HPV感染后病毒DNA中E7、CyclinD1-CDK4復合物等會競爭性結合pRb，使其磷酸化，進而降低pRb活性，造成細胞異常分裂，加重疾病發展〔14〕。p16是一種細胞周期調節因子，在多種細胞周期調控環節中均起到“閘”作用，據報道，p16可競爭性結合CDK4，抑制CDK4活性，預防pRb磷酸化，維持pRb調節作用，確保細胞正常分裂〔15〕。另有動物研究顯示，pRb活性與p16表達存在一定關系，pRb活性降低會負反饋刺激p16基因，導致p16表達異常〔16〕。

本研究結果提示高危型HPV感染老年CC患者的抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表達；抑癌基因p53、p16、pRb低表達與老年CC患者高危型HPV感染有一定關系。分析原因在于，機體細胞中致癌基因與抑癌基因相互制衡，維持細胞周期平衡性，預防腫瘤細胞生成，但當抑癌基因p53、p16等低表達可能會導致致癌基因過表達，損傷細胞DNA，且可激活G1/S環節中調控蛋白，造成損傷細胞異常增殖，促使HPV生成病毒癌蛋白，繼而增強HPV致病力，推進疾病發展，繼而增加高危型的感染風險〔17，18〕。但因宮頸癌患者幾乎超過90%HPV感染均為高危型，故本研究結果并不能直接證實各個抑癌基因的低表達是直接導致老年宮頸癌患者高危型HPV感染的風險因子，加之研究選取的是全部確診為宮頸癌的患者，故抑癌基因的低表達也可能是因感染導致，故二者之間的因果關系，還需要在未來進一步納入其他宮頸病變及宮頸上皮內瘤變的老年HPV感染患者進行研究，進一步證實二者的關系。

綜上，老年CC患者多為高危型HPV感染，且抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表達，抑癌基因p53、p16、pRb低表達可能是老年CC患者高危型HPV感染的風險因素，臨床應據此提出針對性干預方案，以指導老年宮頸病變患者早期合理干預，以預防高危型HPV感染致CC的發生。