15-二氘脫水穿心蓮內酯的合成和氫-氘交換速率考察

霍志鵬, 劉 迪, 邱 峰

(天津中醫藥大學 中藥學院 組分中藥國家重點實驗室，天津 301617)

近年來氘代藥物逐漸成為新藥研發的熱點之一，氘代藥物因氘(D)元素的同位素效應，有減緩藥物代謝、改善藥代動力學、減少毒性代謝產物以及抑制藥物間的相互作用等優勢。在原有上市藥物或活性成分基礎上進行氘代設計為常用策略，在保持原藥物療效的基礎上，有望改善該藥的代謝特性，降低用藥劑量，發揮更穩定的治療作用[1-2]。穩定同位素標記藥物在生物樣品檢測中作為內標也有廣泛的應用，在《中國藥典》2020年版通則“9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則”中推薦生物樣品質譜檢測時，盡可能使用穩定同位素標記的內標[3]。脫水穿心蓮內酯(穿心蓮丁素)為穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的主要活性成分之一，現代藥理研究顯示，脫水穿心內酯和其衍生物具有具有抗炎、抗癌以及抗病毒等藥理活性[4-6]。

Scheme 1

本研究合成了脫水穿心蓮內酯15-位兩個氘原子取代的15-二氘脫水穿心蓮內酯，并考察了其在不同pH下的H-D交換速率，以期為脫水穿心蓮內酯和其衍生物的氘代藥物合成提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Advance 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內標)；LC-IT-TOFMS型液相聯用離子阱飛行時間質譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 15-二氘脫水穿心蓮內酯的合成

量取四氫呋喃10 mL，加入無水亞硫酸2.0 g，振搖1 min，靜置24 h后取上層除水的四氫呋喃備用。將上述四氫呋喃2 mL和氧化氘1 mL混勻，加入脫水穿心內酯(1) 30 mg，三乙胺50 μL，60 ℃反應4 h。減壓除去溶劑，殘余物經硅膠柱(洗脫劑：二氯甲烷/乙酸乙酯=1/0～4/1,V/V)層析純化，收集(二氯甲烷/乙酸乙酯=4/1,V/V)主要流分，旋蒸濃縮蒸干后得白色粉末狀固體(A)21 mg。

15-二氘脫水穿心蓮內酯(A): 白色粉末狀固體，收率70%;1H NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 7.63(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.87(brs, 0.05H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.85(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.5, 148.9, 146.6, 134.3, 127.3, 121.3, 108.1, 78.6, 69.8, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H26D2O4{[M+Na]+}357.2005, found 357.1993。

脫水穿心蓮內酯(B)： 白色粉末狀固體，收率85%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.65(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.89(brs, 2H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.84(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.4, 148.9, 146.8, 134.3, 127.1, 121.3, 108.1, 78.5, 70.2, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H28O4{[M+Na]+}355.1880, found 350.1886。

1.3 15-二氘脫水穿心蓮內酯在不同pH緩沖溶液中氘代的交換速率

用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉分別配置成0.067 mol·L-1的pH 分別為6、 7和 8的磷酸緩沖液。用碳酸鈉、碳酸氫鈉配置成0.1 mol·L-1的pH為10的緩沖液。取反應產物用甲醇配置成0.1 mg·mL-1溶液，分別取1 mL 15-二氘脫水穿心蓮內酯溶液，與上述pH分別為6， 7， 8和10的緩沖液1 mL混合，搖勻。室溫放置，分別于不同的時間用LC-IT-TOFMS檢測氘元素保留速率。

2 結果與討論

2.1 合成條件的選擇

脫水穿心蓮內酯在水中難溶，本研究采用了無活性質子溶劑非氘代四氫呋喃作為輔助溶劑以使脫水穿心蓮內酯全部溶解。結果顯示，四氫呋喃中的H在反應中無明顯的H-D交換，產物脫水穿心蓮內酯-d2在15-氘代比例大于85%，在反應產物的硅膠柱純化中使用的二氯甲烷和乙酸乙酯也為非氘代試劑。使用非氘代溶劑在H-D交換反應中助溶，可節約試劑成本。

δ

2.2 15-二氘脫水穿心蓮內酯的結構表征

反應原料脫水穿心蓮內酯與文獻報道的脫水穿心蓮內酯特征一致[7]，反應產物和脫水穿心蓮內酯相比，15-H信號明顯降低，積分僅為0.05個H[8]， 15-C信號因和兩個磁不等價D核耦合裂分，明顯降低，D核量子自旋數為1，單個D核取代產生(2nI+1)=3重裂分[9-11]， 兩個磁不等價D核理論上可對15-C可形成(2nI+1)×(2nI+1)=9重裂分，文中13C NMR圖譜因裂分后峰高降低較多，受基線噪音干擾，未觀察到裂分的細微結構(見圖1和2)。反應產物15-C信號向高場移動了0.4 ppm，和文獻報道的D元素同位素效應引起的位移變化方向一致[10-12]。

δ

文獻報道堿催化用于羰基鄰位(α-位) C—H 鍵氫氘交換，因羰基的吸電子作用，酸性增強，在堿性催化下可與氘代水(氧化氘)發生氫氘交換[13-15]。脫水穿心蓮內酯15-H為α，β-不飽和羰基的γ-位，本研究通過堿催化合成了15-二氘的脫水穿心蓮內酯，表明羰基的吸電子作用可通過共軛的π鍵影響γ-位，使γ-位的酸性增強。脫水穿心蓮內酯7-H為烯鍵的臨位，反應產物中未發現7-H的氘代，提示單一烯鍵的α-位酸性較α，β-不飽和羰基中烯鍵的臨位弱。C—H鍵的氘代速率一定程度上反映了該位點氫解離能力。氘代后化合物在氘代位置的1H NMR譜和13C NMR在對應位置有明顯變化，H信號降低或消失，在全去耦合碳譜的中由于不能完全去掉D核對13C核的耦合，C—D連接的碳譜信號因D核的裂分降低。化合物的氘代對化學特性和結構鑒定研究也有一定的輔助作用。

2.3 15-二氘脫水穿心蓮內酯在不同pH緩沖溶液中氘代的交換速率

兩個15-D取代時質譜上信號較原化合物m/z增加2，一個氘原子取代時，質譜信號較原化合物m/z增加1。因C13自然豐度較高，原化合物存在天然的+1和+2的同位素信號，計算氘原子比例應將天然同位素豐度的影響考慮在內。15-二氘脫水穿心蓮內酯內酯在pH 分別為6， 7和8的溶液中0， 2， 4， 8， 12， 20和192 h的15-氘原子保留比例見表1，在20 h內上述3個pH值溶液的保留比例無明顯降低，在192 h， pH為6的氘原子比例變化不明顯，pH為7的保留比例為77.4%， pH為8的保留比例為49.1%。 pH為10溶液中0～20 h的D原子保留比例見圖3，在pH為10溶液中氘原子比例降低較快，4 h降低至45%， 20 h降低至1.7%。脫水穿心蓮內酯15-H與D交換速率在接近中性的溶液中交換速率較慢，隨pH升高交換速率加快。

表1 15-二氘脫水穿心蓮內酯的C-15位D原子保留比例

Time/h

因氘代試劑成本所限，本研究僅考察了D交換回H的速率，未考察H交換為D速率。D交換回H的速率可為化合物在后續的穩定使用提供支持，藥物服用后一般在數小時內在體內發揮藥效，15-二氘脫水穿心蓮內酯在pH 6～8溶液中20 h無明顯交換，提示其在近似pH值的生理環境中可保持D元素在較高比例。

合成并表征了15-二氘脫水穿心蓮內酯，考察了15-二氘脫水穿心蓮內酯在不同pH值溶液中的H-D交換速率，探討了為α，β-不飽和羰基的γ位氫的酸性。合成的氘代化合物可用于后續生物活性研究，或用于質譜檢測的內標。