宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表達變化及其臨床意義

崔楠，朱小丹，花仲首，張景宏

本溪市中心醫院婦產科，遼寧本溪117000

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大常見女性惡性腫瘤，也是第三大最常見的惡性腫瘤，每年導致265 700人死亡［1-2］。近年來隨著宮頸癌篩查手段的提升和乳頭瘤病毒的覆蓋率擴大，早期診斷率顯著提高，但患者晚期生存率僅40%，復發和轉移是限制療效和預后較差的重要因素，因此迫切需要了解宮頸癌內在機制，以發展新的抗癌策略［3］。非編碼RNAs是一類不編碼蛋白質的RNA，其可通過調節各種基因表達參與腫瘤發生發展［4-5］。同源盒基因D—反義鏈1（HOXD-AS1）是HOXD基因簇中的一種反義lncRNA，其在胃癌、甲狀腺癌等實體腫瘤中呈高表達，作為癌基因參與腫瘤發生發展［6-7］。微小RNA-133a-3p（miR-133a-3p）是一種高度保守的miRNA，其參與調控胃癌和骨肉瘤等實體腫瘤的增殖、侵襲、轉移等行為［8］。有研究［9］發現，lncRNA HOXD-AS1可以介導miR-133a-3p調控宮頸癌細胞增殖和凋亡。因此，猜測lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達可能參與宮頸癌癌癥進展，然而兩者與宮頸癌的關系的研究鮮有報道。2015年1月—2017年12月，我們觀察了宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本溪市中心醫院收治的宮頸癌患者92例，年齡38～83（57.68±8.63）歲；≥60歲53例、<60歲39例。納入標準：①經術后（根治性或姑息性切除）病理檢查確診為宮頸癌；②初次確診，術前未接受任何內分泌、放化療者；③臨床資料完整者；④患者及家屬均知情研究。排除標準：①合并其他部位腫瘤者；②嚴重心、肝、腎等臟器疾病者；③血液系統疾病者；④全身感染性疾病者；⑤血液系統疾病者；⑥妊娠及哺乳婦女。病理類型：75例鱗癌，17例腺癌；腫瘤直徑：≥3 cm 50例，<3 cm 42例；腫瘤分化程度：低分化35例，中高分化57例；國際婦產科聯盟（FIGO）分期［10］：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移59例。手術留取宮頸癌及其癌旁（距離癌組織>5 cm）組織各92例份。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 宮頸組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p檢測方法 取宮頸癌及其癌旁組織標本，剪碎并研磨，TRIzol總RNA抽提試劑盒（無錫百泰克生物技術有限公司，貨號：RP2401）提取組織中總RNA，Nano Drop 1000超微量分光光度計和凝膠電泳檢測RNA濃度、純度、完整性。Takara逆轉錄試劑盒（上海紅榮微再生物工程技術有限公司，貨號：RR036A）合成cDNA，進行qRT-PCR反應，lncRNA HOXD-AS1上游引物：5′-GGCTCTTCCCTAATGTGT?GG-3′，下游引物：5′-CTCTGGTTGGGTGACTGGTT-3′；miR-133a-3p上游引物：5′-CGAGCCTTTG?GTCCCCTTCAAC-3′，下游引物：5′-TCAACTGCTG?GTGTCGTGGAGTCGGC-3′；反應體系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反應條件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、35 s，72℃、30 s，循環40次。分別以GAPDH（上游引物：5′-GGTG?GTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3′）、U6（上游引物：5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′）作內參校正，2-ΔΔCt法計算組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；正態分布且方差齊的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法；Kaplan-Meier曲線繪制生存率，組間生存率比較采用Logrank檢驗；Cox回歸分析法分析宮頸癌患者預后不良影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌、癌旁組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對表達量比較 宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對表達量分別為2.064±0.644、0.947±0.305，癌旁組織分別為1.044±0.275、1.572±0.563，兩者比 較，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組織中lncRNAHOXD-AS1與miR-133a-3p表達的相關性 宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p表達呈負相關（r=-0.663，P<0.05）。

2.3 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌臨床病理參數的關系 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌臨床病理參數的關系見表1，由表1可知，lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關（P均<0.05）。

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌臨床病理參數的關系（±s）

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌臨床病理參數的關系（±s）

臨床病理參數年齡≥60歲<60歲病理類型鱗癌腺癌腫瘤直徑≥3 cm<3 cm腫瘤分化程度低分化中高分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移有 無53 39 75 17 50 42 35 57 53 39 33 59 lncRNA HOXD-AS1 2.104±0.696 2.009±0.570 2.086±0.653 1.966±0.610 2.165±0.688 1.943±0.572 2.228±0.599 1.963±0.655 1.918±0.533 2.271±0.734 2.352±0.693 1.903±0.559 miR-133a-3p 0.935±0.308 0.963±0.303 0.936±0.312 0.984±0.274 0.918±0.301 0.981±0.309 0.869±0.236 0.995±0.333 1.023±0.275 0.839±0.316 0.836±0.258 1.009±0.313

2.4 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達與宮頸癌患者預后的關系 以lncRNA HOXD-AS1、miR-

133a-3p均值將92例宮頸癌患者進行分組，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者（40例）和lncRNA HOXDAS1<2.064患者（52例）術后3年總生存率分別為30.00%（12/40）、67.31%（35/52），兩者比較，P<0.05；miR-133a-3p≥0.947患者（45例）和miR-133a-3p<0.947患者（47例）術后3年總生存率分別為68.89%（31/45）、34.04%（16/47），兩者比較，P<0.05。

2.5 宮頸癌患者預后不良影響因素Cox回歸分析結果 所有患者出院后均通過門診或電話方式隨訪，隨訪2～36個月，中位22個月；死亡47例，存活45例。死亡患者年齡≥60歲35例（74.47%）、鱗癌40例（85.11%）、腫瘤直徑≥3 cm 28例（59.57%）、低分化23例（48.94%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期25例（53.19%）、淋巴結轉移28例（59.57%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 31例（65.96%）、miR-133a-3p≥0.947 14例（29.79%），存活患者年齡≥60歲18例（40.00%）、鱗癌35例（77.78%）、腫瘤直徑≥3 cm 22例（48.89%）、低分化12例（26.67%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期14例（31.11%）、淋巴結轉移5例（11.11%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 9 例（20.00%）、miR-133a-3p≥0.947 31例（68.89%），兩者年齡≥60歲比例、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期比例、淋巴結 轉 移 比 例、lncRNA HOXD-AS1≥2.064比例、miR-133a-3p≥0.947比例比較，P均<0.05。以年齡（≥60歲=1，<60歲=0）、FIGO分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、lncRNA HOXD-AS1（≥2.064=1，<2.064=0）、miR-133a-3p（≥0.947=1，<0.947=0）為自變量，隨訪時間為時間變量，預后（死亡=1，存活=0）為因變量，經多因素Cox回歸分析，顯示FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、lncRNA HOXD-AS1≥2.064為宮頸癌患者預后不良獨立風險因素，miR-133a-3p≥0.947為獨立保護因素（P<0.05）。詳見表2。

表2 宮頸癌患者預后不良影響因素的多因素Cox回歸分析結果

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，與人乳頭瘤病毒持續感染、性行為、分娩次數、多個性伴侶、多孕多產等有關，主要癥狀為陰道流血、不正常陰道排液、接觸性出血等，但早期常無明顯癥狀，大多患者確診時已達中晚期。盡管近年來宮頸癌篩查、手術、放療、化療取得了重大進展，但晚期和復發宮頸癌患者的治療效果仍不令人滿意。腫瘤的生長依賴一系列促癌基因的激活，阻斷這些通路中關鍵胞內蛋白或膜受體，可發揮抑制腫瘤生長、轉移及促進凋亡作用，因此近年來出現了以腫瘤特異性分子靶標為基礎的靶向和免疫療法，雖然顯著延長了宮頸癌患者生存時間，但仍未達到最終效果，因此迫切需要進一步深入研究其分子層面，以揭示新的治療靶點［11］。蛋白編碼基因一直是腫瘤研究熱點，人體中95%以上的蛋白編碼被轉錄為非編碼RNA，在RNA水平就可行駛各自生物學功能，在細胞生長、分化、增殖、上皮間質轉化、凋亡等過程發揮重要調控作用。

lncRNA是一類轉錄本>200個核苷酸的非編碼RNA，可通過影響表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平來調節基因表達，影響細胞生長、分化、增殖［4］。lncRNA HOXD-AS1位于人染色體2q31.2，進化過程中高度保守，近年研究表明，其參與多種惡性腫瘤進展［12-13］。SUN等［12］研究顯示，沉默lncRNA HOXD-AS1可通過絲裂原活化蛋白激酶激酶/細胞外調節蛋白激酶通路抑制肝癌細胞增殖、細胞周期進程、遷移、侵襲。LI等［13］研究顯示，lncRNA HOXD-AS1可通過miR-520c-3p/v-myc禽骨髓細胞瘤病毒癌基因神經母細胞瘤衍生同源體軸促進膽管癌細胞增殖、遷移、侵襲。本研究顯示，宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1表達明顯高于癌旁組織，且與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關，說明lncRNA HOXD-AS1高表達參與了宮頸癌進展。進一步分析顯示，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者術后3年總生存率明顯降低，術后3年死亡增加1.217倍，說明lncRNA HOXD-AS1可作為宮頸癌患者預后評估生物標志物。Ras/細胞外調節蛋白激酶信號通路在腫瘤惡性轉化過程中發揮重要作用，參與腫瘤異常增殖、侵襲、轉移［14］。體外沉默裸鼠宮頸癌細胞lncRNA HOXD-AS1發現，宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力和Ras/細胞外調節蛋白激酶的磷酸化明顯受抑，提示lncRNA HOXD-AS1可通過Ras/細胞外調節蛋白激酶信號通路促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲［15］。CHI等［16］也發現，對順鉑耐藥的宮頸癌細胞中lncRNA HOXD-AS1表達顯著上調，下調lncRNA HOXD-AS1表達可抑制順鉑耐藥宮頸癌細胞的耐藥。上述研究驗證了本研究結果，也提示lncRNA HOXD-AS1可能成為宮頸癌新的治療靶點。

miRNA是一類內源性長約19～25個核苷酸的非編碼RNA，可結合mRNA的3′UTR導致mRNA裂解，降解或抑制蛋白質翻譯，參與細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等調控［5］。miR-133a-3p是一個低氧調節的miRNA，在心臟中含量最豐富，因此其異常表達

多與心臟相關疾病有關，如心肌梗死、心房顫動等［17-18］。近年研究［19-20］表明，miR-133a-3p還參與多種惡性腫瘤進展，HE等［19］發現miR-133a-3p可通過抑制Ⅰ型膠原A1抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和入侵。LI等［20］的研究顯示，miR-133a-3p可通過調節叉狀頭轉錄因子3抑制胃癌增殖和自噬。本研究顯示，宮頸癌組織中miR-133a-3p表達明顯低于癌旁組織，且與FIGO分期、淋巴結轉移有關，說明miR-133a-3p參與了宮頸癌進展。進一步分析顯示，miR-133a-3p≥0.947患者術后3年總生存率明顯提升，為術后預后不良獨立保護因素，說明miR-133a-3p也可作為宮頸癌患者預后評估生物標志物。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路是促進宮頸癌細胞增殖、轉移和抑制凋亡的關鍵通路［21］。研究［9］發現，上調miR-133a-3p表達可通過調控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路抑制宮頸癌細胞增殖、轉移和促凋亡。lncRNA可作為內源競爭RNA競爭占有胞內微小RNA，海綿樣緩沖削減并干涉靶基因mRNA編碼蛋白能力［22］。本研究顯示，宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p表達呈負相關，說明二者可能共同影響宮頸癌患者預后。劉海娟等［9］通過miRcode數據庫預測和雙熒光素酶報告基因證實，miR-133a-3p與lncRNAHOXD-AS1的3′UTR存在結合位點，lncRNA HOXD-AS1能負向調控宮頸癌細胞凋中miR-133a-3p表達影響細胞增殖和凋亡。相反FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結轉移患者的惡性程度增加，同時影響lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p表達水平，進而影響患者的預后狀態。

總之，宮頸癌組織中lncRNA HOXD-AS1表達升高，miR-133a-3p表達降低；兩者均與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關；lncRNA HOXD-AS1≥2.064為宮頸癌患者預后不良獨立風險因素，miR-133a-3p≥0.947為其獨立保護因素；二者可能成為宮頸癌患者預后評估指標。