2型糖尿病腎病患者血漿腸源性內毒素水平變化及其意義

楊帆，陳燁，鄧梅，秦勝花，陸思顏，李金燕

桂林市人民醫院內分泌科，廣西桂林541000

糖尿病腎病是糖尿病的慢性并發癥之一，是一種較為常見的疾病，也是導致終末期腎病的主要原因，發病機制目前仍然不清楚，嚴重影響糖尿病患者的生存質量［1］。糖尿病的高血糖狀態是糖尿病腎病的始動因素，糖脂代謝紊亂及腎臟血流動力學異常是糖尿病腎病的兩大病理生理基礎［2］。糖尿病腎病的治療主要包括血糖、血脂的控制以及腎臟血流動力學的改善，然而即使血糖、血脂、血壓控制達標，仍不能完全阻止糖尿病腎病的發生發展，提示還有其他因素參與了糖尿病腎病的發展過程。近年來，研究者通過對腸道微生物與2型糖尿病的宏基因組關聯分析，發現2型糖尿病患者的腸道微生物譜發生了改變，這導致了血漿LPS水平升高，并且激活炎癥因子，誘導一系列炎癥反應［3-4］。因此，LPS能否通過炎癥途徑影響糖尿病腎病的發生發展需要探討。如果兩者存在相關性，那么調節腸道菌群、降低血漿LPS水平，或者阻斷LPS與免疫細胞表面受體的結合，極有可能可以早期干預糖尿病腎病的發生發展。本研究觀察了2型糖尿病腎病血漿腸源性內毒素（LPS）水平變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1—12月桂林醫學院附屬醫院收治的2型糖尿病患者108例，男60例，女48例；年齡（57.13±9.95）歲；病程6（2～10）年；BMI（23.96±2.83）kg/m2；有吸煙史60.8%，飲酒史53.5%。納入標準：所有研究對象均符合由世界衛生組織（WHO，1999年）糖尿病專家委員會提出的2型糖尿病診斷標準。排除標準：①1型糖尿病、妊娠期間的糖尿病及特殊類型糖尿病；②合并糖尿病急性并發癥，如糖尿病高滲高血糖綜合征、糖尿病酮癥酸中毒或并發各種感染、應激狀態；③甲亢、Cushing綜合征等內分泌疾病；④高血壓病、心肺功能不全、肝膽系統疾病、血液系統疾病、風濕免疫疾病、惡性腫瘤；⑤合并原發性及其他繼發性腎臟疾病，如診斷明確的腎小球腎炎、腎盂腎炎、IgA腎病、腎病綜合征、高血壓腎病等；⑥合并急性胃腸炎、慢性炎性腸病，如克羅恩病、潰瘍性結腸炎等；⑦出現活動性尿沉渣（紅細胞、白細胞或細胞管型等）；⑧泌尿系超聲發現尿路梗阻、腎盂腎炎、結石等；⑨采樣前2周內服用抗生素或益生菌等微生物制劑。以尿微量白蛋白/肌酐（ACR）為標準，將患者分為糖尿病腎病（ACR>30μg/mg，34例）和糖尿病 組（ACR<30μg/mg，74例）。另選健康體檢人群32例作對照（健康對照組），男16例，女16例；年齡（52.38±6.75）歲；BMI（23.20±1.88）kg/m2；有吸煙史（每天至少吸1支煙并持續6個月或以上）8例（25%），飲酒史（長期飲酒達6個月以上或近1周大量飲酒達500 mL以上）10例（31.2%）。納入標準：①無糖尿病、高血壓病、內分泌疾病、風濕免疫疾病、腎臟疾病、血脂異常、感染性疾病；②無急性胃腸炎、慢性炎性腸病，如克羅恩病、潰瘍性結腸炎等；③采樣前2周內未服用抗生素或益生菌等微生物制劑。本研究已獲得桂林醫學院附屬醫院倫理委員會批準，所有受試者簽署紙質知情同意書。

1.2 觀察指標及觀察方法 ①血漿LPS：所有研究對象空腹8 h，使用肝素作為抗凝劑的采血管采集靜脈血2 mL，30 min以1 000×g速度離心15 min，用移液器吸出上層血漿，裝于凍存管中，編號，將標本放于-80℃冰箱保存備用，避免反復凍融。使用人脂多糖/內毒素（LPS）ELISA檢測試劑盒檢測血漿LPS水平，試劑盒反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。以標準品的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，使用Curve Expert軟件繪制標準曲線，樣品的OD值取兩孔的平均值，根據樣品的OD值，在標準曲線上查出相應的濃度。②研究對象均空腹8 h，采集空腹靜脈血，比濁法檢測血清FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Scr、Cys-C，離子交換高效液相色譜法檢測全血HbA1C，免疫層析法檢測血漿hs-CRP。采用中國eGFR課題協作組推出的公 式 計 算eGFR=169×（Scr/88.4）-0.608×Cys-c-0.63×（Age）-0.157×0.83（if female）。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較選用T檢驗，多組比較選用方差分析；非正態分布的計量資料以M（QL~QU）表示，比較選用秩和檢驗。計數資料比較選用χ2檢驗。兩個變量之間關系符合正態分布，用Pearson相關系數描述，不符合正態分布，用Spearman相關系數描述。使用二元Logistic回歸進行糖尿病腎病的影響因素分析，首先采用單因素Logistic回歸對變量進行初篩，再用多因素Logistic回歸調整混雜因素的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較 血漿LPS及血清TC、HDL-C、LDL-C、hs-CRP水平和eGFR比較見表1。

2.2 各組血清FPG、TG及全血HbA1C水平比較 血清FPG、TG及全血HbA1C水平比較見表2。

表2 各組血清FPG、TG、HbA 1C水平比較［M（QL~QU）］

2.3 血漿LPS與年齡、性別、吸煙、飲酒、家族史、病 程、BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、HbA1C、eGFR、hs-CRP等研究指標的相關性 血漿LPS水平與年齡、病程、hs-CRP呈正相關（r=0.216、0.267、0.501，P均<0.05），與eGFR呈負相關（r=-0.318，P<0.05），與性別、吸煙、飲酒、BMI、FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、HbA1C均無相關性（P均>0.05）。

表1各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較（±s）

表1各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較（±s）

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05。

組別糖尿病腎病組糖尿病組健康對照組n 34 74 32 LPS（pg/ml）1.97±0.21*△1.75±0.21*1.62±0.18 hs-CRP（mg/L）5.39±1.75△2.06±1.18-TC（mmol/L）4.51±0.85 4.35±1.01 4.47±0.53 HDL-C（mmol/L）1.00±0.23*1.05±0.27*1.51±0.30 LDL-C（mmol/L）2.89±0.64 2.71±0.81 1.60±0.40 eGFR［mL/（min·1.73 m2）］77.50±39.69*△97.50±27.57*104.93±14.60

2.4 2型糖尿病腎病發病影響因素和危險因素 為了初步篩選2型糖尿病腎病的影響因素，將患者各指標分別帶入二元Logistic回歸進行單因素Logistic回歸分析，結果顯示病程、eGFR、hs-CRP、LPS與2型糖尿病腎病發病有關（P均<0.05）。將單因素分析有統計學差異的指標為自變量，使用多因素二元Logistic回歸分析評價2型糖尿病腎病發病的危險因素，納入的變量包括病程、eGFR、hs-CRP、LPS，結果顯示LPS、hs-CRP是2型糖尿病腎病發病的危險因素（P均<0.05）。詳見表3、4。

表3 2型糖尿病腎病發病單因素Logistic回歸分析結果

表4 2型糖尿病腎病發病單因素Logistic回歸分析結果

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的慢性并發癥之一，也是導致終末期腎臟病的主要原因之一。研究［5-8］表明，我國2型糖尿病患者患糖尿病腎病的比例為10%～40%。糖尿病導致的慢性腎臟病所占的比例也逐漸增高，嚴重影響患者的生存質量。以往我們對糖尿病腎病的治療主要包括血糖、血脂的控制以及腎臟血流動力學的改善，然而即使患者的血糖、血脂、血壓控制達標，仍不能完全阻止糖尿病腎病的發生發展，提示除了上述兩點因素外，還有其他因素參與糖尿病腎病的發展過程。近年我們通過深入的研究，發現糖尿病腎病的發生、發展還與氧化應激、慢性炎癥、腎單位細胞內信號通路的激活等因素相關［9-12］。目前研究表明，2型糖尿病患者的腸道菌群失調導致了血漿LPS水平升高，并且激活炎癥因子，誘導一系列炎癥反應［4］。因此，我們猜想血漿LPS是否可以介導腎臟的慢性炎癥反應，促進糖尿病患者的腎臟病變？本研究通過分析2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平變化，以探索早期干預糖尿病腎病的治療靶點。

脂多糖，又稱內毒素，是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，也是由微生物群釋放的。脂多糖由脂質A（疏水區）和O抗原核心區（親水區）組成，是一種兩親性分子。脂多糖影響促炎細胞因子的分泌，被認為是胰島素抵抗的觸發因素［13］。本研究顯示，2型糖尿病患者血漿LPS水平較健康對照組高。分析原因，可能由于腸道菌群失調導致革蘭氏陰性桿菌比例增多以及腸道通透性增加，增多的內毒素通過通透性增加的腸壁進入血液循環。升高的血漿LPS水平使得糖尿病患者體內的炎癥反應可能更加嚴重，且可能與2型糖尿病的發生、發展相關。這與目前所認為的代謝性內毒素血癥增加了2型糖尿病的患病風險的觀點一致［14］。體外研究發現，LPS干預的2型糖尿病腎病患者的單核細胞TLR4、NF-κB P65蛋白表達和IL-6水平明顯高于健康對照組［15］。TLR4的表達與糖尿病腎病密切相關，TLR4可以導致NF-κB的核轉位及相應免疫細胞的激活而發生轉錄，釋放促炎癥細胞因子，導致細胞增殖和凋亡，加重糖尿病腎病的發展，而LPS在人體內可以與CD14結合，作為TLR4的配體［16］。由此可見，LPS可以加重糖尿病患者腎臟的炎癥反應，促進浸潤的炎癥細胞釋放炎癥因子，導致腎損傷。本研究還顯示，2型糖尿病腎病患者hs-CRP水平較2型糖尿病患者高。作為臨床上常用的一種炎癥標志物，hs-CRP的水平不僅可以獨立預測糖尿病、代謝綜合征的發病風險，且與2型糖尿病腎病的發生有關。本研究結果與已知研究結果基本一致。本文結果顯示，2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平高于2型糖尿病患者，而且與hs-CRP呈正相關，因此LPS也可能能夠預測糖尿病腎病的發病風險。本文結果還表明，LPS還與年齡、病程呈正相關，可能是由于血漿LPS水平主要受腸道菌群的影響，而年齡大、病程長的患者體內有害菌比例更高導致。最后通過多因素二元Logistic回歸分析，顯示LPS、hs-CRP可能是2型糖尿病腎病的危險因素，提示導致糖尿病腎病患者產生慢性炎癥反應的因素是多樣性的，而LPS極有可能是主要因素之一。

總之，2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平升高，其與糖尿病腎病的發生、發展相關，有可能為早期干預糖尿病腎病提供治療靶點，調節腸道菌群、降低血漿LPS水平或者阻斷LPS與免疫細胞表面受體的結合極有可能可以早期干預糖尿病腎病的發生發展，LPS有可能為早期干預糖尿病腎病提供治療靶點。本研究仍存在有不足之處，血漿LPS水平與糖尿病腎病的相關性研究為病例對照研究，需要進一步進行前瞻性隊列研究來進一步確認兩者的因果關系。其次，2型糖尿病腎病的發生發展極其復雜，尤其是在人體內，它涉及多種危險因素和遺傳背景，而這是一項涉及單一因素的臨床研究，故存在一定的局限性。此外，如果條件允許，我們還需要進一步研究患者糞便中的的腸道菌群與LPS水平，與血漿LPS水平進行對比，以排除潛在感染因素對實驗的影響。