1例前庭水管擴大患兒SLC26A4基因的新變異研究

胡瀾也 陳潔 辛淵 方旭華 焦宇

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心耳鼻咽喉口腔頜面外科(上海200127)

耳聾可由遺傳因素或環境因素導致，至少一半的耳聾可歸因于遺傳因素，其中同時具備其他特殊臨床特征的稱為綜合征性耳聾（syndromic hearing loss,SHL），不具備其他臨床特征的稱為非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss,NSHL）[1,2]。前庭水管擴大（enlarged vestibular aqueduct,EVA）是導致NSHL的常見內耳畸形，典型特征為進展性感音神經性聽力下降[3]，診斷主要依靠顳骨CT及MRI影像學檢查[4]。1996年Griffith等[5]首次描述前庭水管擴大有家族遺傳性，隨后證實其與溶質轉運家族26-成 員 4（solute carrier family 26 member 4,SLC26A4）基因變異相關[6]。迄今為止，在不同國家和種族中已發現超過500種SLC26A4基因變異（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SLC26A4）。本研究中，我們對1例EVA聽障患兒及其父母進行全外顯子測序，發現了1種SLC26A4基因的新變異，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

先證者為一名2歲女孩。患兒及其父母均來自中國河南省，為漢族人。患兒出生聽力篩查未做，自幼對聲反應差，言語發育遲緩。出生時無窒息等異常，既往無腦膜炎、耳外傷、耳毒性藥物應用史，無耳聾家族史。來我院行人工耳蝸植入手術，術前進行體格檢查、聽力學檢查和影像學檢查。

本研究通過本院倫理委員會論證批準，并由法定監護人簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 聽力學檢查與影像學檢查

患兒術前進行的聽力學檢查包括耳鏡檢查、畸變產物耳聲發射（distortion product otoacoustic emission,DPOAE）、聲導抗、聽覺腦干誘發電位（auditory brainstem response,ABR）和多頻穩態誘發電位（auditory steady-state response,ASSR）。影像學檢查包括顳骨CT和內耳MRI。根據世界衛生組織倡導的耳聾分級標準，聽力損失程度分為：輕度（26～ 40dB HL）、中度（41～ 60dB HL）、重度（61～ 80dB HL）和極重度（>80dB HL）。由于受試者年齡較小，無法配合純音聽閾測試，取ASSR 0.5-4kHz范圍內的平均閾值作為定向條件反射的近似值[7]。

1.2.2 基因測序與變異驗證

分別采集患兒及其父母的外周血3～ 5ml，枸櫞酸鈉抗凝，應用Gentra Puregene血液試劑盒（Qiagen,德國）提取基因組DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。利用試劑盒SureSelectXT Library Prep Kit（Ag‐ilent Technologies,美國）捕獲外顯子，在測序平臺Illumina Hiseq X Ten System（Illumina，美國）上進行高通量測序。測序數據經軟件NextGENe?（Soft‐Genetics，美國）匹配分析后，上傳至在線軟件系統Ingenuity Variant Analysis（Ingenuity Systems，美國）進行變異過篩及解釋，候選變異經北京六合華大基因科技有限公司上海分公司進行Sanger測序驗證。

1.2.3 生物信息學分析

應 用 PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/ge‐nome_submit_2.php?species?human）、SIFT（http://sift.Jcvi.org/）和 MutationTaster（http://www.muta‐tiontaster.org/ChrPos.html）預測SLC26A4基因變異的潛在致病性。

2 結果

2.1 臨床檢查結果

術前常規全身體格檢查及專科檢查未見明顯異常。DPOAE示雙耳未引出；聲導抗示雙耳A型；氣導ABR示左耳反應閾90dB nHL，右耳反應閾100dB nHL；骨導ABR示雙耳反應閾大于40dB nHL；ASSR示雙耳極重度感音神經性聾。顳骨CT示雙側前庭水管擴大；內耳MRI可見T2WI序列雙側小腦半球表面擴大的內淋巴囊和前庭水管（圖1）。

圖1 內聽道MRI可見前庭水管擴大（藍色箭頭所指處）和內淋巴囊擴大（紅色箭頭所指處）Fig.1 The inner ear MR scan images show the enlarged ves‐tibular aqueduct(blue arrows)and the enlarged endolymph sac(red arrows)

2.2 基因檢測及生物信息學分析結果

先證者存在SLC26A4c.919-2A>G（c.IVS7-2A>G）和c.403C>A（p.His135Asn）的變異（圖2）。父親為c.919-2A>G的雜合變異攜帶者，母親為c.403C>A的雜合變異攜帶者（圖3）。

圖2 先證者及其父母基因測序圖中的異常序列。先證者在SLC26A4基因中呈c.403C>A/c.919-2A>G變異，其中c.403C>A來源于母親，c.919-2A>G來源于父親Fig.2 Sequence electropherograms of abnormal sequences from three members of this family.The proband harbored two variants in the SLC26A4 gene in the form of c.403C>A/c.919-2A>G.The proband’s father was a heterozygous carrier of the c.919-2A>G variant,and her mother was a heterozygous carrier of the c.403C>A.

圖3 前庭水管擴大患兒家系圖。正方形和圓形分別代表男性和女性。Fig.3 Pedigree map of the family with EVA.Squares and cir‐cles denote males and females,respectively

c.403C>A（p.His135Asn）位于SLC26A4基因的第4外顯子，導致第135位的組氨酸轉變為天冬酰胺。該變異在人類基因突變數據庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk）中未曾收錄，在gnomAD（http://gno‐mad.broadinstitute.org）、ExAC（http://exac.broadin‐stitute.org）、ESP（http://evs.gs.washington.edu/EVS）和千人基因組計劃（http://www.1000genomes.org）等對照數據庫中亦未見報道。因此，患兒及其母親所攜帶的c.403C>A是SLC26A4基因新發現的變異。通過PROVEAN、PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster等多種軟件預測，該變異可能會影響蛋白結構域的功能，具有潛在致病性（表1）。按照美國醫學遺傳學與基因組學學會（the American College of Medical Genetics and Genomics.ACMG）變異分類標準[8]，歸類為“可能致病性（likely pathogenic）”變異。

表1 c.403C>A（p.His135Asn）變異的生物信息學分析結果Table 1 In silico analysis of the c.403C>A variant

3 討論

SLC26A4基因，也稱作PDS基因（pendred’s syndrome gene,PDS），位于染色體7q22-31.1，包含21個外顯子[9]。其編碼的Pendrin蛋白是一種含有780個氨基酸的高疏水性膜蛋白，具有12個跨膜結構域[9,10]，主要表達于內耳、甲狀腺和腎臟，在液體運輸、陰離子運輸和維持耳蝸內電位中起著重要作用[11-13]。SLC26A4基因變異與EVA有關，擴大的前庭水管使腦脊液壓力傳遞至內耳，進而導致耳聾的發生。EVA患者沒有特定的聽力水平，聽力從正常到極重度聾均有可能。耳聾可以是先天性的，或者發生在出生后1-2年。聽力下降模式可呈現為緩慢進展、突然加重或者波動性，但通常呈進展性。由于EVA的第三窗效應，低頻聽力存在氣骨導差。EVA患者最初可能具備接近正常的聽力，這種情況下可暫不處理。隨著波動性和進展性聽力下降，患者需要佩戴助聽器。聽力下降通常會持續進展下去，最終需要進行人工耳蝸植入[3]。

SLC26A4基因的熱點變異體現出地區和種族差異。白種人中主要檢測到的變異為p.L236P（c.707T>C）、p.T416P（c.1246A>C）和 IVS8+1G>A（c.1001+1G>A）[14]，南美和北美分別以 p.V609G（c.1826T>G）和 IVS8+1G>A（c.1001+1G>A）為主[15]，捷克人群中最常見的變異為p.V138F（c.412G>T）[16]，韓國人群中主要為 p.H723R（c.2168A>G）[17]，中國人群中主要為IVS7-2A>G（c.919-2A>G）和p.H723R（c.2168A>G）[18]。本研究中我們對1例非綜合征性耳聾的患兒及其聽力正常的父母進行了全外顯子測序。先證者在SLC26A4基因中存在 c.919-2A>G（c.IVS7-2A>G）和 c.403C>A（p.His135Asn）兩個變異，其中c.919-2A>G來源于父親，c.403C>A來源于母親。既往研究表明，c.919-2A>G屬于剪接位點變異，位于第7內含子，是中國人群中SLC26A4基因最常見的致病變異[18]。本研究新發現的c.403C>A屬于錯義變異，位于第4外顯子，根據前文生物信息學分析結果，該變異使第135位的組氨酸轉變為天冬酰胺，可能會影響Pendrin蛋白結構域的功能，按照ACMG變異分類標準，歸類為“可能致病性”變異。本文家系為攜帶者婚配，遺傳方式為常染色體隱性遺傳，若該家庭有再次生育意愿，孕期應進行產前診斷，以避免再次生育耳聾后代。

本研究發現了1種SLC26A4基因的新變異，擴展了中國人群中SLC26A4基因變異譜，有助于為患有EVA的耳聾患者的遺傳咨詢提供更多信息。