耳蝸內毛細胞中帶狀突觸相關鈣離子通道的研究進展

范歷強 陳正儂

上海交通大學附屬第六人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（上海200233）

Ca2+通道是一種跨越細胞膜的結構，其化學本質是蛋白質，控制著Ca2+進入細胞的過程。Ca2+信號與很多重要生理功能相關，例如心臟收縮、基因轉錄等。聲音誘導的內耳電信號在向中樞傳遞的過程中十分重要的環節-內毛細胞的帶狀突觸傳導，也與Ca2+通道的參與密切相關。目前，聽覺突觸中Ca2+通道的功能仍然處于不斷探索的階段，對突觸中Ca2+通道的研究是揭露聽覺奧秘的重要一環。下面主要介紹在內毛細胞帶狀突觸活動中Ca2+通道的探索。

1 Ca2 +通道-胞吐作用偶聯

快速同步胞吐作用需要胞外機制與突觸前Ca2+通道緊密耦合。成像技術表明，帶狀突觸是胞吐作用的關鍵點，并且帶狀結構對于快速、同步的神經遞質釋放十分重要。

內毛細胞帶狀突觸的活動區包含大量的鈣通道簇，這些簇主要由L型Cav1.3亞基組成[1,2]，輔助Cavβ2[3]，以及可能存在但尚未確定的Cavα2δ亞基，該通道的聚集取決于多個分子支架，包括巴松管或帶狀結構或兩者兼有[4,5]以及RIM2α和β[6]。這些蛋白質的緊密的相互作用和其相應位置的正確對于建立正常的鈣通道分布是必需的[4,6]，并且對于穩定AZ區域內的大的易釋放池（readily releasable pool，RRP）至關重要[4,6,7]。此外，內毛細胞AZ還包含其他支架，例如Piccolo的短剪接變體Piccolino[8]，以及與突觸前Ca2+通道直接相互作用的Usher蛋白harmonin，調節鈣通道的門控開放并可能促進其蛋白酶體的降解[9,10]。盡管內吞機制仍然未知，但最近發現它包括AP-2[6,11]、動力蛋白[12,13]、兩性蛋白和網格蛋白重鏈[13]。

除了與囊泡Ca2+感受器有關的通道的精確位置，其數量和開放概率外，Ca2+感受器的Ca2+結合特性和在AZ處的胞質Ca2+緩沖決定了偶聯[14]。以前的工作已經通過結合聽力剛出現時的小鼠內毛細胞中的全細胞Ca2+解偶聯和Cm測量來檢測融合后Ca2+傳感器的Ca2+結合特性[15,16]。在這些實驗中，表明需要四到五個Ca2+在融合之前協同結合，并且可以推測感受器的整體Ca2+親和力較低。但是需要注意的是，這種方法會產生大量胞吐作用（增加的膜相當于細胞表面的15%）。因此，它不太可能完全由內毛細胞AZ的胞吐作用介導，但也可能涉及突觸外胞吐作用。與Cm測量相關的特異性缺乏可能會使它的相應解釋復雜化，需要通過使用更完善的方法使AZ（最好是較成熟的內毛細胞）進行胞吐來重新討論突觸小泡融合的內在Ca2+依賴性。

毛細胞有多個AZs，平均每個AZs含有數十個Ca2+通道[1,17-19]。然而，在給定的內毛細胞內，無論其具體在細胞內的位置如何，每個AZ的Ca2+通道數都有顯著差異。這種突觸前異質性被認為與聲音編碼的巨大動態范圍有關[17,20-22]。一根聽神經纖維具有較少Ca2+通道且需要更大去極化電位的突觸后AZ，預期應該有更小的自發放電率，更高的閾值和更大的動態范圍[23]。

內毛細胞中AZs的Ca2+通道密度和通道激活的電壓依賴性成相反的分布梯度，即靠近SGN的一側，Ca2+通道密度越高，而更難以被激活，遠離SGN的一側則Ca2+通道密度越低，但更容易被激活[24]。遠離SGN的AZs的位置，輕微的去極化即可激活鈣的內流。Ca2+內流在弱去極化時被激活。AZs分布在面對SGNs的這一側，AZ大小與鈣通道相關，且更大。

圖1 [25]內毛細胞和耳蝸傳入纖維之間的突觸。Fig.1[25]The synapse between the inner hair cell and cochlear afferent fiberA.圖中細胞左側面向蝸軸，纖維（紅色）具有高閾值和低自發放電率；右側背向蝸軸，纖維具有低閾值和高自發放電率。B.毛細胞突觸中的CaV1.3型鈣通道。C.突觸囊泡的高倍鏡視野，谷氨酸轉運蛋白Vglut3和Ca2+感受器otoferlin。D.突觸小泡周期圖。A.Fibers(red)synapsing on the left(modiolar)side have high threshold and low spontaneous discharge;fibers synaps‐ing on the right(pillar)side are thought to have low thresh‐olds and high resting spontaneous firing.B.CaV1.3-type cal‐cium channels in hair cell synapses.C.High power view of synaptic vesicle,glutamate transporter Vglut3,and Ca2+sensor otoferlin.D.Conventional view of the life cycle of the synap‐tic vesicle.

2 Ca2+內流與胞吐耦合

在去極化過程中，鈣主要通過CaV1.3 L型Ca2+通道內流，觸發RRP小泡的胞吐。Ca2+內流耦合到囊泡融合的方式決定了突觸傳遞的性質[26]。可區分為兩種情況[27-30]：（1）單純 Ca2+納米域控制，其中驅動給定囊泡融合的Ca2+由單個電壓門控Ca2+通道貢獻；（2）單純Ca2+微米域控制，其中Ca2+傳感器處的Ca2+量由一系列Ca2+通道整體控制，單個通道的影響可忽略不計。

帶狀結構下方條狀簇中各個Ca2+通道的確切位置及其分子連接的囊泡釋放位點仍尚待確定。生物物理約束建模[17,31]在識別分辨控制AZ成熟的分子過程，尤其是在出生后早期發育過程中Ca2+通道-突觸小泡偶聯的密切性逐漸提高這方面[17,19,31]是有用的。免疫組化顯示內毛細胞AZ中最大鈣離子通道開放概率的估計值，根據方法的不同在0.2[19]和 0.4[17]之間。

在一項研究[19]中，從P20沙鼠身上研究了底回內毛細胞（～ 30 kHz）。使用5mM細胞外鈣離子和5uM BayK 8644進行單鈣通道記錄。當在34-37℃下進行記錄時，BayK 8644的使用是必不可少的，因為在沒有BayK 8644的情況下，大多數單通道開口沒有被解決，并且表觀亞導電開口狀態變得非常頻繁。已知BayK 8644能使L型Ca2+通道更長時間的開放，但不影響第一潛伏期，也不影響其基本的Ca2+電導和電壓敏感性。因此，在活化動力學沒有改變的情況下，它使Ca2+電流峰值增加約3倍。根據結果計算得鈣離子通道開放概率為0.21。

3 Ca2+流入-胞吐作用偶聯在發育中的變化

在發育過程中，偶聯從Ca2+的微米域樣控制到Ca2+的納米域樣控制[17]。這是根據成熟以及非成熟AZ的結構中胞吐的生物物理模型提出的。該模型表明，在每個成熟位點中，各個通道的Ca2+流入主導著Ca2+驅動的胞吐作用。作者基于形態學和生物物理數據，研究成熟AZ和未成熟AZ的Ca2+通道和Ca2+傳感器的范式形態；對于成熟AZ，在囊泡Ca2+傳感器接觸的情況下，14個囊泡隨機分布在80nm×420nm的突觸前致密帶的長邊處。在突觸前致密帶內放置了14-90個通道；在情況1中，隨機分布了36個通道。在情況2中，除了36個隨機分布的通道外，還有14個通道與Ca2+感受器物理接觸，模擬分子耦合，被稱為“專用通道”，以突出顯示其在給定囊泡的Ca2+信號中的優勢。在情況3中，只布置了14個與囊泡鈣傳感器進行物理接觸的通道。針對每種情況，考慮了100種不同的隨機通道和囊泡位置實現。實驗結果支持成熟內毛細胞中胞吐由鈣納米域控制這一概念。

Moser建議[26]，未來的實驗應闡明簇內單個Ca2+通道的位置和遷移性，并剖析將釋放位點連接至最近的Ca2+通道的推定接頭蛋白。此外，進一步闡釋CaV1.3 Ca2+通道復合物的分子組成，測試成孔CaV1.3α亞基的剪接變體的存在和作用，將有助于理解支配Ca2+通道表達的異質性的分子機制，激發-分泌偶聯的發育性緊縮，以及各個Ca2+通道變異體對塑造各個內毛細胞激活域中突觸前Ca2+內流效率的貢獻。

4 Ca2+緩沖機制

內源性Ca2+緩沖對于突觸信號傳導很重要。在感覺HC中，Ca2+對于頻率調諧，傳入突觸傳遞和傳出調制至關重要。為了分離這些信號的傳導途徑并保持高時間保真度，Ca2+必須受到時間上的控制且在空間上被限制在其作用位點。細胞通過定點的Ca2+通道實現Ca2+內流和通過Ca2+與胞質緩沖液結合后排出游離Ca2+，來實現這個目的。在各種EF-hand Ca2+結合蛋白中，有些主要功能是作為Ca2+依賴信號蛋白的（例如，鈣調蛋白和Ca2+結合蛋白 1-8，CaBP1-8），而 另 一 些 [parvalbumin-α（PVα），calbindin-D28k（CB）和Calretinin（CR）]被認為主要功能為Ca2+移動的緩沖液。不同物種的毛細胞強烈表達PV，CB，在某些情況下還表達CR。這可能由于功能上的需要不同分化出不同的Ca2+信號傳導機制，反應了Ca2+需要具有不同生物物理特性的緩沖液。

內源性鈣緩沖作用已經在不同種類的毛細胞中進行了研究[32-35]，均顯示出鈣結合位點的高濃度。在青蛙和雞的毛細胞中，parvalbumin-3[34]和CR的濃度高達幾個毫摩爾[32,36]。

對大鼠進行的免疫電鏡研究表明，內毛細胞中有數百個蛋白鈣結合位點[33]。在沙鼠內毛細胞中的膜片鉗研究報告了相當于大約0.4 mM的1,2-雙（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸（BAPTA）的內緩沖劑[37]。在最近一項使用三重基因敲除小鼠（Pv-/-，Cb-/-，Cr-/-）的研究[31]中，盡管Ca2+依賴性失活電流增強，但在長時間去極化過程中仍觀察到了過度的胞吐。在這個三重KO模型中，內毛細胞對RRP小泡的胞吐作用保持不變，這與預估的Ca2+通道和釋放位點的緊密空間耦合一致。這些結果表明內源性EF-hand-Ca2+結合蛋白對內毛細胞突觸遞質釋放的影響不大。這可能反映了Ca2+源（即Ca2+通道）和在AZ處進行融合的囊泡之間非常小的距離（“耦合距離”）。為了確定內毛細胞中的這種耦合距離，我們建立了一個模型來預測當改變Ca2+源和釋放的Ca2+傳感器之間的距離時所觸發的相對胞吐量。該模型用于測定有效耦合距離，該距離與在室溫下不同Ca2+緩沖條件下實驗觀察到的胞吐最佳匹配。在成熟的內毛細胞中，有效的“耦合距離”估計為17nm。這很好地符合Ca2+納米結構域的胞吐作用的控制，類似于先前的估計（大約23納米[38]）。

在該研究中，用不同濃度的合成Ca2+螯合劑，結合慢（EGTA）或快（BAPTA）動力學和刺激-分泌耦合的計算模型，結合Ca2+緩沖取代法測定外周血細胞Cm的變化。該實驗表明，內源Ca2+緩沖液相當于1mM合成的Ca2+結合位點，其中一半的動力學速度與BAPTA相當。

在這只KO小鼠中，突觸的聲音編碼基本上沒有改變，這表明過度的胞吐發生在突觸外。結論是EF-hand-Ca2+緩沖液調節突觸前內毛細胞功能，促進代謝有效的聲音編碼。

綜上所述，最近的研究對內毛細胞Ca2+通道探索包括單個鈣通道的功能、Ca2+通道的蛋白結構、蛋白亞基的功能、Ca2+通道和Ca2+內流與突觸囊泡及其胞吐的偶聯方式、發育中Ca2+通道與突觸囊泡偶聯的變化、以及活動域（AZ）周圍Ca2+緩沖機制進行了探索，幫助我們對Ca2+通道在聽覺突觸中對聲音信號的編碼的作用有了更深刻的理解。但是，對于內毛細胞上的Ca2+通道仍有很多未解之迷，仍需要進行進一步的探索。