正常比格犬ABR與ASSR的研究

朱崇元魏興梅趙勇高志強馮國棟*

1濰坊醫學院耳鼻咽喉科（濰坊261053)

2中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院耳鼻喉科（北京100730）

短聲聽性腦干反應（click auditory brain re‐sponse,c-ABR）與聽性穩態反應（auditory steadystate response,ASSR）作為兩種客觀的評估聽力水平的電生理測試方法，目前在臨床上應用廣泛[1-3]。客觀測聽法（ABR、ASSR、耳聲發射等）不受主觀意識的影響，可用于無法配合測試的受試者。c-ABR和ASSR作為兩種主要的客觀測聽方法，有各自的優點和特色。c-ABR是指以click聲刺激基底膜及聽覺系統產生一系列電活動，經平均疊加記錄到的反應。c-ABR通常出現5個以上波形，通過觀察波形變化來評估聽力，臨床上常通過V波來評估反應閾[4,5]。而ASSR是將不同頻率分別對載波進行調幅調制，調制后的聲波可在雙耳同時給出，這些頻率的調幅調制聲能同時激活耳蝸基底膜上相應的部位產生反應，從而產生幾個載波的聽閾[6,7]。c-ABR和ASSR測試都不受被測試者的睡眠、藥物等因素的影響。c-ABR主要反映2-4 kHz的耳蝸區域（高頻區），缺乏頻率特異性，當聽力損失在某一特定低頻范圍時，可能無法發現聽力損失或低估聽力損失的程度。而ASSR測試具有頻率特異性，可雙耳同時給聲，各調制調幅同時激活耳蝸基底膜，生成結果時間較c-ABR短，但比c-ABR更易受各種條件的干擾[8]。

進行耳科疾病相關的動物實驗，需要評估聽力變化，由于動物無法做出主觀反應，所以不能用主觀測聽法，此時客觀測聽法就顯示出其重要作用。關于犬類的客觀聽力測試，1980年，Morgen等[9]在做藥理學實驗時，首次將c-ABR用于測試犬的聽力。之后陸續有文獻報道犬的c-ABR聽力測試值，如Shin等[10]測試犬c-ABR正常聽力閾值在0 dB nHL左右，與相關報道的犬c-ABR存在差別，近10年來，犬的ABR報道較少。而對犬類ASSR聽力測試的研究罕見。同時，由于比格犬是目前國際公認的實驗用犬，故本實驗擬測試正常比格犬的c-ABR及ASSR閾值，為今后建立耳科疾病的動物模型提供聽力學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與麻醉

使用比格犬（2-2.5歲，10-15kg）為實驗動物，動物由北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠提供，動物數量為6只（均為雄性），沒有耳科疾病病史，實驗前用耳內鏡檢查比格犬鼓膜正常，將耳垢清理干凈。進行顳骨CT掃描，見聽骨鏈、耳蝸完整，咽鼓管通暢，鼓室內未見積液。（如圖1、圖2）使用舒泰-50（0.2mg/kg）肌注麻醉動物后，行氣管插管，使用異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，深圳，中國）吸入麻醉（誘導5%，流量5ml，維持1.5%，流量2ml）。呼吸麻醉機（舒普思達醫療設備有限公司，南京，中國）輔助呼吸通氣，呼吸機模式采用A/c，呼吸頻率為12次/分。本研究經過北京協和醫院實驗動物福利倫理委員會批準（編號：XHDW-2019-039）。

圖1 比格犬軸位。Ma：錘骨，C：耳蝸，TB：鼓泡，ET：咽鼓管Fig.1 Axial view of beagle dog.Ma:malleus,C:cochlea,TB:tympanic bulla,eustachian tube

圖2 比格犬冠狀位CT。C：耳蝸，VW：前庭窗，Ma：錘骨，In:砧骨，TB：鼓泡，TC:鼓室，EAM：外耳道。Fig.2 Coronal CT of beagle dogs.C:Cochlea,VW:vestibu‐lar window,Ma:malleus,In:incus,TB:tympanic bulla,TC:tympanic cavity,EAM:external auditory canal.

1.2 測試方法

（1）麻醉生效后，使用耳內鏡（Karl Storz,Tut‐tlingen,Germany）清理雙側外耳道后觀察鼓膜情況（確保雙側外耳道清潔及鼓膜完整）。

（2）使用聽力測試儀（Neurosoft Ltd.,Ivanov,Russia）（該設備已進行校準，可在正常環境下測試聽力）在安靜但未屏蔽的房間測試聽性腦干反應（Click Auditory Brainstem Response，c-ABR）并記錄。測試方法為：使用針刺電極，記錄電極位于顱頂正中，負極位于鼻背部，兩側參考電極位于兩側乳突部位，極間電阻＜1kΩ。通過插入式耳機給聲，刺激聲為click聲（圖3），給聲刺激重復率為21.1 次/秒，掃描時間15 ms，濾波0.1～3 kHz，平均疊加1024次。自80 dB nHL開始，以10 dB遞減，接近閾值時以5 dB遞減；能夠檢測到的反應最低水平即為反應閾值（圖4）。記錄閾值和80 dB HL時I、Ⅱ波、V波的潛伏期及I-V波的間期以及I波、II波、V波的振幅,記錄一側耳各刺激強度下I波、II波、V波的潛伏期與振幅，觀察潛伏期與振幅的變化情況。

圖3 箭頭1為負極電極，箭頭2為紀錄電極，箭頭3、4為參考電極，箭頭5、6為插入式耳機，箭頭7為聽力測試儀，箭頭8為裝有聽力測試軟件的電腦Fig.3 Arrow 1 is the negative electrode,arrow 2 is the re‐cording electrode,arrows 3 and 4 are the reference electrodes,arrows 5 and 6 are plug-in earphones,arrow 7 is the hearing tester,and arrow 8 is the computer equipped with hearing test software.

圖4 聽性腦干反應測試結果示意圖。此圖中25 dB nHL為c-ABR閾值。Fig.4 Diagram of auditory brainstem response test results.In this figure,the c-ABR threshold is 25dB nHL.

（3）同樣使用上述儀器測試ASSR，電極接連同上，刺激聲的載波頻率分別為500 Hz，1 kHz，2 kHz和 4 kHz，調制頻率分別為：500Hz，360–720 Hz;1000 Hz,720–1440 Hz;2000 Hz，1440–2880 Hz;4000 Hz,2880–5760 Hz。每個強度的測試設定掃描次數為100次，記錄時間不長于5分鐘。記錄雙耳各頻率的閾值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。對c-ABR與ASSR各頻率的平均聽閾用閾值均數±標準差（）計算。stimulation intensity in beagle dogs

2 結果

根據比格犬c-ABR的聽力圖（圖4），可見刺激強度越高，波形的峰值及形狀越清楚。觀察80 dB nHL波形,存在I、Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅵ波，IV一般不存在，或位于V波的斜坡上與V波融合，V波是深度負波谷之前的波峰[11]。I波與II波的波峰最高，Ⅴ波的振幅較低，Ⅱ波隨著刺激強度的下降而持續時間最長，潛伏期隨著刺激強度的下降而延長（圖5），IV波不是很明顯。根據圖6可得各波的振幅隨刺激強度的降低而下降。6只實驗動物（12耳）的平均c-ABR閾值為27.1±10.1 dB nHL，80 dB nHL時I波潛伏期平均為1.09±0.1ms,振幅為1.98±1.2μV;Ⅱ波的潛伏期平均為 1.98±0.11ms，振幅為1.3±0.65μV,V波的潛伏期為3.74±0.32ms，振幅為1.45±0.88μV，I-V波間期為2.65±0.31ms。（如表1）。通過觀察ASSR各頻率測試波形變化（圖7），確定ASSR各頻率閾值見表2，可見1 kHz的ASSR閾值最高，其次為500 Hz，4kHz閾值最低，與c-ABR的閾值最為接近。

圖5 比格犬ABR的I、II、V波潛伏期與刺激強度的關系圖Fig.5 The relationship between I,II,V wave latencies and

表1 c-ABR80 dB nHLⅠ波、Ⅱ波、V波、I-V波間期的平均潛伏期及振幅（±s）Table 1 Average latencies and amplitudes of wave I,wave Ⅱ,wave V and the latency of wave I-V in c-ABR 80 dB nHL（±s）

表1 c-ABR80 dB nHLⅠ波、Ⅱ波、V波、I-V波間期的平均潛伏期及振幅（±s）Table 1 Average latencies and amplitudes of wave I,wave Ⅱ,wave V and the latency of wave I-V in c-ABR 80 dB nHL（±s）

Latency(ms)Amplitude(μV)wave I 1.09±0.101.98±0.113.74±0.322.65±0.31 1.98±1.201.3±0.651.45±0.88 wave II wave V wave I-V

表2 ASSR各頻率的平均聽閾（±s）Table 2 Average hearing threshold of ASSR frequencies（±s）

表2 ASSR各頻率的平均聽閾（±s）Table 2 Average hearing threshold of ASSR frequencies（±s）

Frequency（kHz）Threshold（dB HL）0.5 55.42±16.8557.83±11.4848.75±13.3437.50±10.11 1 2 4

圖6 ABR中I、II、V波的振幅與刺激強度的關系圖Fig.6 The relationship between the amplitude of I,II,V waves and stimulation intensity in ABR

圖7 多頻穩態誘發電位測試過程示意圖。Fig.7 Diagram of the test process of auditory steady-state re‐sponse.

3 討論

結果顯示正常比格犬c-ABR波形可形成5個波以上，看80 dB nHL的波形,I波與II波的波峰最高，Ⅱ波隨著刺激強度的下降而持續時間最長，潛伏期隨著刺激強度的下降而延長，波形同Shin[10]、Wilson[12]的研究結果相似。本實驗80 dB nHL時I波潛伏期平均為 1.09±0.1ms,振幅為1.98±1.2μV;Ⅱ波的潛伏期平均為1.98±0.11ms，振幅為1.3±0.65μV,V 波的潛伏期為 3.74±0.32ms，振幅為1.45±0.88μV，I-V波間期為2.65±0.31ms（表1），與Shin的實驗結果顯示75 dB nHL時的各波的潛伏期相近，但兩者因儀器的校準不同，選取出現清晰波形的刺激聲強度不同，可能產生部分實驗誤差。本實驗的正常比格犬c-ABR聽力閾值約為27.1±10.1 dB nHL,而Shin等[10]實驗的兩種犬（Dalmatian和Jack Russell）的聽力閾值分別為0±6.9 dB nHL、-4.7±10.9 dB nHL，本實驗的聽力閾值高。

1991年STAIN等[13]認為c-ABR聽力閾值在40 dB nHL左右的結果與本實驗結果較相近。還有文獻報道犬的頭顱大小與c-ABR閾值大小無關，而對潛伏期長短有影響，頭顱越小的犬，潛伏期越短[14]。研究發現c-ABR在正常人中的閾值為30 dB nHL左右，與本實驗得到的比格犬c-ABR的閾值相近，同時比格犬c-ABR波形與人相比，Ⅱ波振幅較大，持續時間最長，Ⅴ波振幅小，持續時間較長，而人V波最為顯著，持續時間最長，Ⅱ波振幅小，不顯著。兩者在V波之后都有一個極大的波谷切記，容易識別，IV波與V波是融合在一起的。不過，人的III波高于I波、II波，而比格犬Ⅲ波持續時間短。而人正常c-ABR的I、II波、V波及I-V間期潛伏期較比格犬的長，振幅相對小[15,16]。

c-ABR在其它動物中的測試各有特點，在鼠類c-ABR測試中，分化為5個波，以Ⅱ波出現率最高，并以Ⅱ波的消失為閾值，與犬相似，但閾值為30 dB SPL左右,比犬的閾值30 dB nHL（65 dB SPL左右）低[17]。之前還有文獻報道鼠類測試以Ⅳ波、Ⅴ波來判斷閾值[18]。小型豬的c-ABR,分化為7個波，以V波出現率最高，并作為判斷閾值的標志，Ⅱ波出現率也挺高，振幅與Ⅴ波相似，可輔助判斷閾值，閾值為25-30 dB SPL。小型豬Ⅴ波振幅比犬的振幅高[19]。

c-ABR作為目前最常用的一種客觀測聽方法，但其缺點是缺乏頻率特異性，只能反應2-4 kHz頻率范圍的聽力，難以反映各頻率的純音聽閾，具有局限性。短純音聽性腦干反應（tone burst auditory brain stem response,Tb-ABR）具有頻率特異性，但用時長[20]。而ASSR作為一種具有頻率特異性的客觀測聽法，ASSR是以對頻率特異性載波進行調制后的調制波為刺激信號產生的腦電反應，可與Tb-ABR進行各頻率的比較。與c-ABR、Tb-ABR相比，ASSR檢測具有快速簡便、客觀判斷結果的特點，且其最高輸出要比ABR高，ASSR可多頻率左右耳同時測量，測試用時短[16]。故ASSR可以補充c-ABR的不足，使聽力測試更準確。

本實驗測得比格犬正常ASSR中500 Hz，1 kHz，2 kHz和4 kHz的閾值分別為55.42±11.48 dB HL、57.83±11.48 dB HL、48.75±13.34 dB HL、37.5±10.11 dB HL（表2）。結果發現1 kHz的閾值最高，4 kHz的閾值最低，c-ABR的閾值與ASSR的4 kHz的閾值接近，符合之前文獻報道的c-ABR反應2-4 kHz的耳蝸高頻區的特征[20]。以往文獻中報道正常人的ASSR也是1 kHz的閾值最高，而2 kHz的最低。出現差異的原因可能是實驗對象的不同，也可能是比格犬的樣本量產生的誤差。根據文獻報道中人的各頻率閾值情況，發現比格犬各頻率的閾值均比人的高[7]。

本研究的局限性一方面在于樣本量有限，不能排除測試誤差對結果造成的影響；另一方面Tb-ABR與ASSR都具有頻率特異性，在人的聽力測試中，這兩者之間的比較分析較多，較c-ABR更具可比性。但因Tb-ABR需要花費較長時間，這一實驗結果c-ABR數據在一定程度上可反映正常犬類的聽力情況，可為今后的研究提供參考。

4 結論

比格犬ASSR正常閾值較正常人類的稍高，c-ABR的潛伏期較短，Ⅱ波振幅高，V波振幅低，兩者振幅相反。c-ABR的閾值更接近ASSR較高頻率的閾值。