成都地區471994例新生兒耳聾基因篩查突變情況分析

鄒凌蔡娟楊馨婷張冠斌

1成都市婦女兒童中心醫院（成都610031）

2生物芯片北京國家工程研究中心,北京102206.成都博奧獨立醫學實驗室（成都611130）

聽力障礙是人類常見的出生缺陷之一，我國每年新增6～ 8萬耳聾新生兒[1]。耳聾病因復雜，60%與耳聾基因遺傳相關，數據顯示，非綜合征耳聾是最常見的感音神經性聾類型，占遺傳性耳聾的70%，可以分為常染色體顯性(DFNA，15%～20%)、常染色體隱性(DFNB，80%)、性連鎖(DFN X-linked，l%)和線粒體遺傳(1%)四類[2]。非綜合征型耳聾(non-syndromic hearing loss，NSHL)已知的致聾基因已有121個,涉及常染色體顯性遺傳49個，隱性遺傳76個，X-連鎖遺傳5個，1000多種致病變異[3]。本研究中，我們對成都市22個區（市）縣2016年7月-2019年6月出生的471994名新生兒應用遺傳性耳聾基因芯片進行耳聾基因篩查，用以評估成都市不同區域新生兒中常見遺傳性耳聾基因的突變頻率和類型。

1 對象與方法

1.1 對象

2016年7月至2019年6月，對成都市22個區（市）縣出生的471994名新生兒進行耳聾基因篩查。

1.2 方法

1.2.1 采集血片

22個區(市)縣的產科執業機構專業人員與新生兒監護人簽署知情同意書后，填寫信息卡，按衛生部《新生兒疾病篩查技術規范》（2010年版）采集新生兒足跟血，制成濾紙干血片。

1.2.2 核酸提取

用打孔器取直徑為6mm的干血斑1片至1.5mL離心管中，使用天根生化的口腔拭子基因組提取試劑盒，按照操作規程進行DNA提取，并應用NanoQ微量分光光度計測定DNA濃度，滿足濃度>2ng/μL，儲存于-20°C備用。

1.2.3 核酸擴增

應用基于微陣列芯片法的十五項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測15個常見耳聾基因突變位點(博奧生物)，包括 GJB2基因(c.35delG、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT)、GJB3基因(c.538C>T)、SLC26A4基因(c.919-2A＞G、c.2168A＞G，c.1174A＞T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.1707+5G>A)、線粒體12SrRNA基因(m.1555A>G、m.1494C>T)。每份核酸擴增時，分為A、B、C三個體系，每個體系均為多重擴增，包含20μL擴增混合物和5μL模板DNA。A、B、C三管的熱循環程序相同，按照試劑盒說明書進行設置。

1.2.4 產物雜交

擴增后，從同一份核酸樣品的三管擴增產物中分別取20μL產物充分混勻，然后加入30μL按照說明書預先制備好的磁珠懸液，混勻后靜置10 min，隨后借助磁力板上除去上清。加入新配制的0.1M NaOH 120μL，混勻后反應10 min，除去上清。加入40μL雜交緩沖液，混勻后除去上清；加入20μL雜交緩沖液混勻后獲得雜交液。將芯片及蓋片依次放入雜交盒,取15.5μL上述制備好的雜交液加到微陣列芯片的點陣上，密封雜交盒，放入50℃水浴鍋中，雜交1h。

1.2.5 雜交后洗片

按照說明書依次配制好洗液I和洗液Ⅱ。從雜交盒中取出芯片插入清洗槽中的芯片架，啟動清洗程序，自動完成洗液I和洗液Ⅱ的清洗。清洗結束后，把芯片架掛到離心架上，1000 r/min離心2 min。

1.2.6 掃描讀片

用芯片掃描儀LuxScan-10K/B和耳聾基因檢測分析系統進行芯片掃描和結果判斷。

1.3 質量控制

DNA提取、PCR擴增、雜交過程的所有試劑及器皿均進行嚴格的消毒。對無法判斷結果的樣品進行重復實驗，并隨機抽取5%樣品進行重復實驗。DNA濃度測定按照5%進行抽檢，濃度均達到實驗要求。所有陽性檢測結果均使用一代測序進行復核，線粒體突變還增加一次芯片法復檢，野生型結果隨機抽檢1%使用一代測序進行復核。

1.4 統計學方法

利用SPSS18.0軟件，采用卡方檢驗進行數據的分析與比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總體陽性檢出情況

篩查471994名新生兒，檢測出突變攜帶者19016例，陽性攜帶率4.03%（19016/471994），其中GJB2單基因陽性檢出率最高，為2.20%（10382/471994），其次由高到低分別為SLC26A4基因1.27%（6010/471994）、線 粒 體 12SrRNA0.33%（1545/471994）（含59例復合性突變中有線粒體12SrRNA突變）、GJB3基因 0.20%（928/471994）及多基因復合突變0.04%（210/471994），其中純合/復合雜合突變82例。各基因型中，GJB2基因c.235delC單雜合突變型的檢出率最高，為1.75%（8279/471994）；其次為SLC26A4基因c.919-2A>G單雜合突變型（檢出率為0.84%，3968/471994）。具體19016例耳聾基因陽性突變攜帶者基因突變情況表見表1。

表1 19016例陽性突變攜帶者基因型Table 1 The genotype of 19016 positively detected patients

上接表1

2.2 等位基因突變頻率

2.2.1GJB2基因

如表2所示，本研究共檢出10553例GJB2基因陽性攜帶者，其中純合/復合雜合突變54例（含1例多基因突變的純合突變），雜合突變10329例，含GJB2基因的多基因突變170例。GJB2基因等位基因突變頻率為 50.26%（10607/10553×2），其中c.235delC最高，為39.94%（8429/10553×2），其次分別 為 c.299_300delAT（8.00%）、c.176_191del16（2.04%）及c.35delG（0.28%）。

表2 10553例GJB2基因陽性攜帶者等位基因突變頻率Table 2 The mutant allele frequency in GJB2 among 10553 positively detected patients

2.2.2SLC26A4基因

如表3所示，本研究共檢出6149例SLC26A4基因陽性攜帶者，其中純合/復合雜合突變28例（含1例多基因突變的復合雜合突變），雜合突變5983例，含SLC26A4基因的多基因突變138例。SLC26A4基因等位基因突變頻率為50.23%（6177/6149×2），其中c.919-2A>G突變頻率最高，為32.79%（4032/6149×2），其次為 c.1229 C>T（6.27%）和c.2168A＞G（3.91%）。

表3 6149例SLC26A4基因陽性者等位基因突變頻率Table 3 The mutant allele frequency in SLC26A4 among 6149 positively detected patients

2.3 不同區（市）縣陽性突變攜帶者檢出情況

對19016例耳聾基因陽性突變攜帶者按照新生兒出生地區（市）縣進行統計分析，邛崍（4.49%，c2=8.04，P=0.005）和簡陽（4.32%，c2=5.22，P=0.026）的總突變率明顯高于成都市平均水平。溫江（3.71%，c2=5.41，P=0.020）和新都(3.74%，c2=4.67，P=0.031)的突變率明顯低于成都市平均水平。采用卡方檢驗，P<0.05，差異有統計學意義。其中線粒體12SrRNA突變率：大邑（0.47%，c2=7.96，P=0.005）和簡陽（0.42%，c2=5.36，P=0.021）的攜帶率明顯高于成都市平均水平，蒲江（0.17%，c2=5.47，P=0.019）、青白江（0.21%，c2=4.19，P=0.041）和溫江（0.24%，c2=5.04，P=0.025）明顯低于成都市平均水平。采用卡方檢驗，P<0.05，差異有統計學意義，具體統計結果見表4。

表4 以新生兒出生地統計22個區（市）縣篩查結果(卡方檢驗）Table 4 The carried rate of gene in the 22 districts and counties(chi-square test)

3 討論

本研究項目中，成都地區新生兒耳聾基因陽性突變攜帶率為4.03%（19016/471994），與前期成都地區呂康模等[4]研究中檢出的攜帶率3.19%（542/17000）相比明顯增高，考慮是與所檢測的耳聾基因突變位點數增加有關。2014年呂康模等[4]只檢測了4個基因的9個位點，而本研究中，檢測的突變位點數增加到15個，新增的6個突變位點（SLC26A4基因c.1174 A＞T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.1707+5G>A)等位基因突變頻率合計為13.5%（1664/12298）。由于檢測位點數的增加，陽性攜帶者的檢出率也增高，而且增加的這6個位點都是與大前庭導水管綜合征密切相關SLC26A4基因突變位點，更加有利于大前庭導水管綜合征的高危人群的早發現早診斷。與全國數據相比較，本研究與阮宇等[5]北京地區新生兒檢測4個基因9個位點檢出的攜帶率4.51%(3412/75649)，潘麗等[6]珠海地區新生兒檢測4個基因20個位點檢出的攜帶率4.15%（406/9775）相一致；低于李曉澤等[7]山西長治地區新生兒檢測4個基因9個位點檢出的攜帶率5.15%（984/19113），潘蕾等[8]天津地區新生兒檢測4個基因20個位點檢出的攜帶率5.40%(4423/81929)；高于李瑪等[9]廣州地區新生兒檢測4個基因9個位點檢出的攜帶率3.68%(266/7234)，劉冬霞等[10]廣東清遠地區新生兒檢測4個基因13個位點檢出的攜帶率2.64%(96/3630)。可見，由于國內新生兒耳聾基因篩查方式、檢測突變位點數以及所在地區均存在差異，耳聾基因陽性檢出率不盡相同。成都地區新生兒的耳聾基因攜帶率處于全國的中間水平，基因突變仍是本地區先天性聾兒的主要病因。新生兒耳聾基因篩查能夠從分子水平發現可能出現聽力損傷的高危新生兒，明確聽力損失的病因，還能了解當地的耳聾基因突變特點，為制定有針對性的耳聾預防和干預措施提供參考。目前針對耳聾基因導致的遺傳性耳聾，人工耳蝸和助聽器是最有效的手段[11]，早期明確病因后，可以更早地采取康復干預措施，把我們聽力障礙診治的目標從1-3-6:1月齡內篩查，3月齡內診斷，6月齡內干預，提高為1-2-3[12]，從而有效提高康復干預的效果，讓更多耳聾嬰幼兒盡早回到有聲世界，融入主流社會。

以等位基因突變頻率計算，本研究GJB2基因中c.235delC突變頻率最高，為39.94%，其次分別為c.299_300delAT（8.00%）、c.176_191del16（2.04%）及c.35delG（0.28%）。SLC26A4基因中c.919-2A>G突變頻率最高，為32.79%，其次為c.1229 C>T（6.27%）和c.2168A＞G（3.91%）。戴樸等[13]2019年研究報道的GJB2基因常見致病突變位點為c.235delC，突變頻率為61.00%，其次為c.299_300delAT（14.88%）；SLC26A4基因常見致病突變位點為c.919-2A>G，突變頻率為51.99%，其次為c.2168A＞G（10.34%）。本研究與之比較，GJB2基因突變譜一致；而SLC26A4基因突變譜具有地域特異性，c.1229C>T的突變頻率高于c.2168A＞G，為僅次于c.919-2A>G的第二常見致病突變位點。但本研究的等位基因突變頻率均低于戴樸等[13]的報道，原因在于，本研究的研究對象為新生兒中致聾基因突變陽性攜帶者，而非戴樸等[13]研究中的攜帶致聾基因突變的耳聾患者，但仍可說明，GJB2和SLC26A4為成都地區新生兒常見致聾基因。由于耳聾基因芯片篩查位點數的限制，本研究中篩查的GJB2和SLC26A4基因12個位點并未包括全部已知致病位點，GJB2和SLC26A4基因中分別有19.82%和22.68%的致病突變位點未能檢測到[13]。所以，對于有基因位點單雜合突變，又有聽力損失的新生兒一定要進行診斷性基因測序檢測，排除少見致聾位點突變可能性，盡可能明確聽力損失的病因，做到更有效地個體化、精準康復干預。同時，完善耳聾基因篩查隨訪體系[14]，對于所有耳聾基因陽性攜帶者都應定期隨訪其聽力情況。

本研究中，成都市共篩查出線粒體耳聾基因攜帶者1545例。這些新生兒均為耳毒性藥物敏感個體，同時這些患兒家庭中平均存在10個以上的母系成員，他們也因攜帶同樣基因突變而為藥物性耳聾敏感個體，要及時向整個母系家族成員進行宣教，通過科學用藥指導來有效避免藥物性耳聾的發生。這些敏感個體在成都市不同區縣分布很不均衡，以出生地進行統計，大邑和簡陽的線粒體基因突變攜帶率最高，需要特別加強這兩個區域的科學用藥指導宣傳，尤其針對攜帶者的母系家族成員應避免使用耳毒性藥物。究其原因，考慮線粒體突變遵循母系遺傳，女性陽性攜帶者區域內婚配可能是主要因素，環境等其他原因還需進一步研究調查。

本研究調查結果顯示，成都的22個區(市）縣中，邛崍和簡陽的新生兒耳聾基因突變攜帶率明顯高于平均水平，其父母中單方或雙方攜帶者比率也較高，生育二胎時為陽性攜帶者甚者耳聾患兒的比率也同樣較高。建議這些陽性攜帶者的父母及家族成員在生育二胎之前一定要先進行耳聾基因檢查，在婚配和生育時也需要明確其配偶耳聾基因攜帶情況，必要時要進行產前診斷及干預，避免先天性聾兒的出生。把邛崍和簡陽做為育齡青年和家庭優生優育健康教育宣傳的重點區域，在常規婚檢和孕檢中增加耳聾基因篩查項目，針對育齡人群開展科普宣教和遺傳咨詢。

4 結論

成都市新生兒耳聾基因篩查已經從四個基因9個位點增加到了四個基因15個位點，篩查出來的陽性突變攜帶率也從3.19%增加到4.03%。同時研究發現成都地區SLC26A4的突變譜具有地域特異性，c.1229C>T的突變頻率高于c.2168A＞G，為僅次于c.919-2A>G的第二常見致病突變位點。另外成都地區耳聾基因包括線粒體12SrRNA突變攜帶率在不同區（市）縣分布不平衡，在今后的耳聾出生缺陷防控工作中針對高突變攜帶率的區（市）縣更應加強健康教育，陽性人群婚配、生育指導及耳毒性藥物的合理使用。