湖南地區4132例備孕女性遺傳性耳聾基因篩查結果分析

葛虎 余艷 周梅華 楊瑤 汪靜 張家美 何媛 龔強

長沙金域醫學檢驗實驗室(長沙410000)

聽力障礙是人類中最常見的神經感覺障礙疾病，在新生兒中發生率為1‰～ 3‰，其中由遺傳性因素導致的比例約占60%，包括綜合征和非綜合征形式，具有高度的遺傳異質性[1-3]。目前，與耳聾相關的致病基因已超過300種被報道[4]，分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X染色體隱性遺傳和母系遺傳四種遺傳方式[3]。針對備孕婦女進行高攜帶率基因突變位點篩查可有效降低新生兒耳聾發生率。本研究針對湖南地區4132例備孕婦女血液樣本，18個耳聾致病基因的108個位點進行篩查，統計分析耳聾相關致病基因的突變位點、突變類型及突變頻率等特點，為湖南地區進行耳聾致病基因突變位點篩查提供有效依據。

1 對象與方法

1.1 對象

2018年12月至2019年11月，長沙金域醫學檢驗所有限公司檢測的來源于湖南省各地備孕女性(18-40歲)的4132例血液樣本。本研究獲得長沙金域倫理委員會批準，進行基因檢測前，篩查者均被詳細講解耳聾基因篩查的相關知識。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器

核酸提取或純化試劑盒、遺傳性耳聾基因檢測試劑盒和測序反應通用試劑盒(芯片)(博奧木華基因)，無核酸酶水和NaOH(Sigma)，異丙醇和無水乙醇(分析純、湖南匯虹試劑有限公司)，Qubit?dsDNA HS Assay Kit(invitrogen)。生物安全柜(BioBase)，熒光定量儀(Qubit?3.0 Fluorometer)，恒溫混勻儀(Themo‐mixer c)，移液槍和高速離心機(Eppendorf)，PCR 儀(ABI Veriti)，基因分析儀(BES4000基因分析儀)。

1.2.2 DNA提取

參照核酸提取或純化試劑盒說明書提取樣本DNA，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3 文庫構建與上機測序

參照遺傳性耳聾基因檢測試劑盒說明書配制擴增體系并加入DNA樣本。擴增程序如下：95℃3min；95℃ 15s，60℃ 90s，72℃ 1min，循環 35 次；72℃1min，16℃∞。然后對PCR產物離心30s，利用特定磁珠對PCR產物進行純化和分選，通過Qubit進行定量。并按照一定比例混合文庫，參照測序反應通用試劑盒(芯片)檢測試劑盒說明書對文庫進行上機測序步驟。

1.2.4 結果處理與統計分析

通過博奧木華所開發的在線數據處理系統對測序原始數據進行處理。并針對單基因突變型樣本 200例的SLC26A4、GJB2、GJB3、MT-CO1、MTRNR1以及MT-TL1基因進行突變位點統計分析。

2 結果

對湖南地區4132例備孕女性樣本的18個耳聾基因的108個位點的篩查結果進行統計分析，發現202例含有位點突變，陽性率為4.89%(202/4132)。在檢測的18個基因中，攜帶突變位點的基因有SLC26A4、GJB2、GJB3以及線粒體基因(MT-CO1,MT-RNR1,MT-TL1)，其中SLC26A4(1.69%,70/4132)和GJB2(2.08%,86/4132)基因在備孕女性中的攜帶率明顯高于其他基因，在陽性樣本中分別占34.65%(70/202)和42.57%(86/202)。GJB3基因的陽性率為0.29%(12/4132)，占陽性樣本總數的5.94%(12/202)。另外，發現線粒體基因突變32例，占0.77%(32/4132)。其中MT-CO1和MT-RNR1為主要的線粒體突變基因，陽性率分別為0.34%(14/4132)和0.41%(17/4132)，占陽性樣本總數的6.93%(14/202)和8.42%(17/202)。此外，兩種多基因突變型SLC26A4/MT-RNR1和GJB2/GJB3各1例。詳見表1。

表1 4132例備孕女性樣本中各突變基因的統計結果Table 1 The statistical results of mutant genes in 4132 preg‐nant women samples

數據顯示：200例單基因突變型樣本中，SLC26A4基因突變占35.00%(70/200)，包括19種突變位點(表2)，以及1例復合雜合突變(c.1229C>T/c.1975G>C)（本人聽力正常。小孩已出生3個月，聽力篩查通過）。其中，IVS7-2A>G位點攜帶頻率最高，占SLC26A4基因突變的44.29%(31/70)。86例GJB2基因攜帶7種突變位點(表2)，c.235delC突變69例，占GJB2基因突變的80.23%(69/86)，占單基因突變樣本數的34.50%(69/200)。GJB3基因突變樣本12例，包括1例c.423delATT、7例c.538C>T以及4例c.547G>A。另外，統計結果顯示線粒體基因突變32例，包括14例m.7444G>A(MT-CO1)，17例m.1555A>G(MT-RNR1)以及1例m.3243A>G(MTTL1)。其中，均質突變為線粒體基因主要攜帶方式，占90.63%(29/32)。詳見表2。

表2 200例單基因突變型樣本中各突變位點的統計結果Table 2 The statistical results of mutation sites in 200 single-gene mutation samples

3 討論

本研究針對18個耳聾基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、MYO15A、TECTA、DIABLO、COCH、DSPP、GPR98、DFNA5、TMC1、MT-CO1、MT-RNR1、MTTH、MT-TS1、MT-TL1、PRPS1、MYO7A)進行篩查，發現在湖南地區發生的主要突變基因為SLC26A4、GJB2、GJB3和MT-RNR1，與文獻[5-14]報道一致。在4132例樣本中，通過108個位點篩查到202例陽性樣本，陽性率為4.89%(表1)，高于石亮程等人[9]對長沙地區1951例孕婦進行耳聾基因9位點篩查的陽性率(4.00%)，以及李春成等人[10]對湘潭地區1610例孕婦進行耳聾基因9位點篩查的檢出率(4.29%)。結果表明本研究的檢測范圍更大，具有更高的檢出率，能夠有效地降低假陰性。

通過對耳聾基因108個位點篩查發現本地區攜帶率較高的突變位點為SLC26A4：c.697G>C、c.1229C>T、c.2000T>C、c.2162C>T、c.2168C>T、IVS16-6G>A、IVS7-2A>G ；GJB2：c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT；GJB3：c.538C>T、c.547G>A；MT-CO1：m.7444G>A；MT-RNR1：m.1555A>G。以及已被文獻[15-23]證明與耳聾相關，攜帶率較低的突變位點：MT-TL1(m.3243A>G)、GJB2(c.512in‐sAACG,c.427C>T,c.416G>A,c.257C>G)、GJB3(c.423delATT)、SLC26A4(c.269C>T,c.349delC,c.387delC,c.439A>G,c.589G>A,c.754T>C,c.1336C>T,c.1343C>T,c.1975G>C,c.2027T>A,c.2086C>T,IVS15+5G>A)(表2)。另外，本研究在4132位備孕女性中并未發現m.12201T>C突變位點，而李春成等人[10]的耳聾基因9位點研究在湘潭地區發現了一例m.12201T>C突變。因此，本研究認為湖南地區在耳聾基因篩查的基因位點中需要包含以上位點，以避免備孕女性在篩查過程中被漏檢，從而降低新生兒的耳聾發生率。

另外，在針對孕婦的耳聾相關基因位點篩查的研究中[5-12]，均包含以下7種突變位點：c.235delC、c.299_300delAT、c.176_191del16、c.538C>T、c.2168A>G、IVS7-2A>G、m.1555A>G。同樣，以上7種突變位點在本研究中的總陽性率為3.44%。說明以上7種突變位點在各地區普遍存在，是我國常見的耳聾基因突變位點。除以上7種常見突變位點以外，本研究的其他突變位點的檢出率為1.45%。主要的原因是本研究涵蓋了大量的不常見的致病突變位點，表明僅關注與耳聾相關的常見突變位點不足以有效降低耳聾的發生風險。由此可見，根據本地區耳聾基因位點的突變情況，擴大篩查范圍，可以降低受檢者的假陰性率。綜上所述，在湖南地區，耳聾相關基因篩查范圍必須包含常見的7種突變基因位點，同時也需增加該地區所含有的一些罕見突變位點。