殼聚糖處理對西番蓮果實感病指數、抗病相關酶活性和抗病物質含量的影響

郭 欣，林育釗，林河通,*，李 倩，段睿琦，朱文婧

（1.漳州職業技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；3.亞熱帶特色農產品采后生物學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002）

西番蓮（Passiflora caeruleaL.）俗稱百香果、洋石榴，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區。西番蓮果實在常溫下不耐貯藏，果皮失水皺縮現象嚴重，易發生褐變及出現病斑，導致鮮果貯藏品質下降[1-2]。其中，由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、煙草疫霉（Phytophthora nicotianaeB.de Haan）、灰霉菌（Botrytis cinerealPers.）和菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）等真菌侵染引起的采后果實病害是西番蓮采后品質劣變發生的重要原因之一[3]。如何減少西番蓮果實采后病害造成的損失已成為西番蓮果實采后商品化處理、實際生產等亟待解決的問題。目前對西番蓮果實采后病害的防治主要采用二氯異氰尿酸鈉和丙氯靈等化學防腐劑浸泡處理。然而，化學防腐劑的濫用可能會導致果皮表面殘留并增強病原菌抗藥性，同時有致癌風險以及污染環境等危害[4]。因此，迫切需要研究采后西番蓮果實非化學防腐劑處理的綠色保鮮技術，以控制果實采后病害發生、提高果實采后品質。

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是一種天然、安全、環保的食品保鮮劑[5]。據報道，殼聚糖可通過誘導果蔬采后抗病性來有效地抑制病害的發生，從而延長采后果蔬的貨架期[6-7]。有研究報道，使用殼聚糖溶液浸泡處理葡萄果實和哈密瓜，可增強果實對病原菌的抵抗能力，并且延緩果實色澤轉變[8]；5 g/L的殼聚糖和殼寡糖處理能誘導生姜苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活性及影響PAL、GLU編碼基因的轉錄水平，提高總酚含量，從而減少根莖由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）造成的腐爛[9]。荔枝果實采后經殼聚糖處理后，能提高果實PAL、幾丁質酶（chitinase，CHI）、GLU等抗病相關酶活性及木質素含量，進而降低荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchi）所致采后病害的發生[10]。但有關殼聚糖處理對西番蓮果實采后病害發生的影響效果及其作用機理尚不清楚。當前，常用粉末型的殼聚糖用于新鮮 果蔬的采后處理。但是，粉末型的殼聚糖在用于新鮮果蔬采后處理之前，應將其溶解在適當的酸溶液中，之后再用堿將殼聚糖溶液調節至適當的pH值范圍，以上制備殼聚糖溶液的過程應花費數小時甚至數天才能完成，因此，粉末型的殼聚糖用于果蔬采后處理不太方便。卡多贊（Kadozan）是一種新型的液態殼聚糖，可以用水稀釋得到所需濃度，而無需用酸溶解，也無需用堿調節pH值，卡多贊溶液浸泡是一種方便的新鮮果蔬采后處理方法。本課題組前期研究發現，不同濃度殼聚糖處理都能較好維持采后西番蓮果實貯藏品質，提高其果實耐貯性，其中，以卡多贊稀釋200 倍的保鮮處理效果最好[11]。本實驗研究稀釋200 倍的卡多贊處理對采后西番蓮果實感病指數、抗病相關酶活性和抗病物質含量的影響，旨在闡明殼聚糖處理控制西番蓮果實采后病害發生及其作用機理，為殼聚糖在西番蓮果實采后保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為福建省長泰縣巖溪鎮果園生產的‘福建百香果1號’西番蓮，在果實九成熟采收，果實采后3 h內運至福建農林大學食品貯藏保鮮實驗室，之后進行果實選別，選擇色澤統一、大小均勻、無機械損傷和無病蟲害的西番蓮果實進行實驗。

卡多贊 利統股份有限公司（上海分公司）；冰醋酸、昆布多糖、p-香豆酸、氯化鋇、丙酮、四硼酸鉀、3,5-二硝基水楊酸、β-巰基乙醇、抗壞血酸 南京化學試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DRX-260人工氣候箱、LFP-800T型多功能粉碎機 寧波 江南儀器廠；FA1104N電子天平、ST-360酶標儀 杭州托普儀器有限公司；KH19A高速冷凍離心機 上海 美譜達儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 西番蓮預處理

本課題組在預實驗中采用蒸餾水（對照）和不同濃度卡多贊（稀釋50、100、150、200、250 倍）的溶液浸泡處理西番蓮果實5 min，之后用聚乙烯薄膜袋（厚度0.015 mm）包裝，在相對濕度（relative humidity，RH）80%、（28±1）℃條件下貯藏15 d，其果實商品率分別為14%、20%、36%、46%、57%、27%，結果表明，稀釋200 倍卡多贊溶液處理的西番蓮果實商品率最高，保鮮效果最好[11]。因此，采用卡多贊稀釋200 倍的濃度開展后續實驗。

將挑選、清洗的西番蓮果實隨機分為殼聚糖處理組和對照組，殼聚糖處理組浸泡在稀釋200 倍的卡多贊溶液中5 min；對照組浸泡在蒸餾水中5 min。將浸泡處理后的西番蓮果實取出、晾干表面水分，之后用聚乙烯薄膜袋（厚度0.015 mm）包裝，每袋裝10 個西番蓮果實，每一組處理50 袋。經包裝后的西番蓮果實在RH 80%、（28±1）℃的人工氣候箱中貯藏。貯藏期間，每隔3 d取30 個西番蓮果實（3 袋），用于測定果實感病指數、果皮抗病物質含量和抗病相關酶活力等指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 果實感病指數測定

參照Jiang Χuanjing等[10]的方法將果實表面病斑分為 5 個級別，按下式計算感病指數。

1.3.2.2 果皮抗病物質含量測定

木質素質量分數的測定參照鞠志國等[12]的方法；總酚含量測定參照Lin Yifen等[13]的方法，用沒食子酸（gallic acid，GA）作標準曲線，結果以每千克鮮果皮中的GA質量表示，單位為g/kg。

1.3.2.3 果皮抗病相關酶活力測定

PAL活力測定參照Zhang Zhanquan等[14]的方法，肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰輔酶A（4-coumarate CoA ligase，4-CL）活力測定參照Gao Hui等[15]的方法，肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力測定參照宋小飛等[16]的方法，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定參照王菊華等[17]的方法。CHI和GLU活力測定參照曹建康等[18]的方法。蛋白質含量參照曹建康等[18]的考馬斯亮藍G250染色法測定，以牛血清白蛋白作標準曲線。上述酶活力結果蛋白質量計。

1.4 數據處理與分析

所有指標都重復測定3 次，取平均值。采用SPSS 22.0 分析軟件對數據進行處理，采用T-檢驗法進行顯著性分析。采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖處理對采后西番蓮果實感病指數和外觀品質的影響

如圖1、2所示，西番蓮果實感病指數、果實外觀品質劣變程度和采后病害發生嚴重程度都隨采后貯藏時間的 延長而呈上升趨勢。對照組西番蓮果實在采后第3天已開始出現病害癥狀，其果實感病指數、果實外觀品質劣變程度和采后病害發生嚴重程度在采后整個貯藏期急劇升高。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實感病指數、果實外觀品質劣變程度和采后病害發生嚴重程度在整個貯藏期間都保持在較低水平，至貯藏第15天，殼聚糖處理的果實感病指數為2.21，僅為同時期對照組果實感病指數（3.99）的55.39%。在貯藏3～15 d期間，殼聚糖處理組西番蓮果實感病指數顯著低于對照組果實 （P＜0.05、P＜0.01）。以上結果顯示，殼聚糖處理可顯著抑制采后西番蓮果實病害的發生。

圖1 殼聚糖處理對采后西番蓮果實感病指數的影響Fig.1 Effect of chitosan treatment on disease index of harvested passion fruit

圖2 殼聚糖處理對采后西番蓮果實外觀品質的影響Fig.2 Effect of chitosan treatment on appearance quality of harvested passion fruit

2.2 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮木質素質量分數和總酚含量的影響

從圖3A可知，對照組及殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮木質素質量分數均呈先上升后下降趨勢。對照組西番蓮果實的果皮木質素質量分數在貯藏0～9 d內緩慢上升，9～15 d內緩慢下降。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮木質素質量分數在貯藏0～9 d內快速上升，9～12 d內略有下降，貯藏12 d之后快速下降。進一步比較發現，在貯藏3～15 d期間，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮木質素質量分數顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖3 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮木質素質量分數（A） 和總酚含量（B）的影響Fig.3 Effect of chitosan treatment on contents of lignin (A) and total phenols (B) in pericarp of harvested passion fruit

從圖3B可知，對照組及殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮總酚含量總體均呈下降趨勢。但與對照組果實相比，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮總酚含量下降較緩慢，貯藏至第15天時，其果皮總酚含量與貯藏前相比僅減少23.3%，而對照組果實的果皮總酚含量則減少了56.6%。顯著性分析結果表明，在貯藏3～15 d期間，殼聚糖 處理組西番蓮果實的果皮總酚含量極顯著高于對照組 （P＜0.01）。

2.3 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮PAL、C4H、4-CL、CAD活力的影響

如圖4A所示，對照組西番蓮果實的果皮PAL活力在貯藏0～3 d內快速上升，3～6 d內急劇下降，6～9 d內快速上升，但在貯藏9～15 d內緩慢下降。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PAL活力在貯藏0～3 d內急劇上升，3～6 d內快速下降，但在貯藏6～12 d內緩慢上升，貯藏12 d之后則緩慢下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PAL活力在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏3～15 d期間，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PAL活力極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖4 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮PAL（A）、C4H（B）、 4-CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig.4 Effect of chitosan treatment on activities of PAL (A), C4H (B), 4-CL (C) and CAD (D) in pericarp of harvested passion fruit

如圖4B所示，貯藏期間，對照組和殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮C4H活力整體均呈上升趨勢。對照組西番蓮果實的果皮C4H活力上升較緩慢，如貯藏至第15天時，其果皮C4H活力相比0 d僅上升45.18%。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮C4H活力上升較快，且在整個貯藏期間都保持在較高水平，如貯藏至第15天時，其果皮C4H活力相比0 d增幅高達168%。顯著性分析結果表明，在貯藏9～15 d期間，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮C4H活力極顯著高于對照組（P＜0.01）。

如圖4C所示，對照組西番蓮果實的果皮4-CL活力在貯藏0～6 d內略有上升，6～9 d內快速上升，但在貯藏9～12 d內快速下降，貯藏12 d之后則緩慢上升。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮4-CL活力在貯藏0～3 d內急劇上升，3～6 d內快速下降，6～9 d內快速上升，6～12 d內緩慢上升，貯藏12 d之后則緩慢下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮4-CL活力在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏第3、12天和第15天時，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮4-CL活力均極顯著高于對照組（P＜0.01）。

如圖4D所示，對照組西番蓮果實的果皮CAD活力在貯藏0～3 d內緩慢上升，3～6 d內緩慢下降，貯藏6 d之后則快速下降。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CAD活力在貯藏0～3 d內快速上升，3～6 d內快速下降，貯藏6 d之后則緩慢下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CAD活力在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏第3天及貯藏9～15 d時，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CAD活力都極顯著高于對照組（P＜0.01）。

以上結果顯示，殼聚糖處理能誘導提高采后西番蓮果皮PAL、C4H、4-CL、CAD活力，促進木質素等抗病物質的合成。

2.4 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮PPO和POD活力的影響

如圖5A所示，對照組西番蓮果實的果皮PPO活力在貯藏0～3 d內較快下降，在貯藏3～6 d內緩慢上升，貯藏6～9 d內緩慢下降，貯藏9 d之后則較快上升。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PPO活力在貯藏0～3 d內略有下降，在貯藏3～9 d內快速上升，在貯藏9～15 d內快速下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PPO活力在整個貯藏期間都保持在較高水平，如在貯藏至第9天時，其果皮PPO活力比對照組果實高53.3%。顯著性分析結果表明，在貯藏6～12 d內，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮PPO活力極顯著高于對 照組（P＜0.01）。

如圖5B所示，對照組西番蓮果實的果皮POD活力在貯藏0～3 d內略有上升，3～9 d內較快下降，貯藏9～15 d內則較快上升。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮POD活力在貯藏0～6 d內較快上升，6～9 d內略有下降，9～12 d內緩慢上升，貯藏12 d之后則緩慢下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮POD活力在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏6～15 d內，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮POD活力極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖5 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮PPO（A）和POD（B）活力的影響Fig.5 Effect of chitosan treatment on activities of PPO (A) and POD (B) in pericarp of harvested passion fruit

以上結果顯示，殼聚糖處理能誘導提高采后西番蓮果皮參與酚類代謝的PPO、POD活力，從而提高采后西番蓮果實的抗病性。

2.5 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮CHI和GLU活力的影響

如圖6A所示，貯藏期間，對照組和殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CHI活力整體均呈上升趨勢。對照組西番蓮果實的果皮CHI活力上升較緩慢。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CHI活力上升較快，且在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏9～15 d期間，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮CHI活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

如圖6B所示，對照組西番蓮果實的果皮GLU活力在貯藏0～3 d內略有上升，3～6 d內快速上升，貯藏6 d之后則快速下降。而殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮GLU活力在貯藏0～6 d內急劇上升，6～9 d內略有下降， 貯藏9 d之后則急劇下降。與對照組果實比較，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮GLU活力在整個貯藏期間都保持在較高水平。顯著性分析結果表明，在貯藏3～12 d內，殼聚糖處理組西番蓮果實的果皮GLU活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖6 殼聚糖處理對采后西番蓮果皮CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig.6 Effect of chitosan treatment on activities of CHI (A) and GLU (B) in pericarp of harvested passion fruit

以上結果顯示，殼聚糖處理能誘導提高采后西番蓮果皮病源相關蛋白家族CHI、GLU活力，從而提高采后西番蓮果實的抗病性。

3 討 論

3.1 殼聚糖處理減緩西番蓮果實采后病害發生與木質素、總酚含量的關系

當果蔬受到外界病菌侵染時，自身會進行一系列防御反應，激活果蔬抗病相關酶活力，提高抗病性物質的合成。酚類物質和木質素是植物中的重要抗病物質，它們在植物抗病性中起重要作用[4,10,19]。其中酚類物質對病原菌有抑制作用；而構成植物細胞壁的木質素可增加病原菌侵入細胞的阻力，從而起到抗病作用[20-21]。 本實驗研究表明，對照組西番蓮果實采后病害嚴重程度和果實感病指數隨采后貯藏時間的延長而逐漸增加 （圖1、2），果皮木質素質量分數在采后貯藏0～9 d內呈現上升趨勢，在貯藏第9天時出現峰值，之后下降（圖3A）。 據此推斷，采后西番蓮果實在貯藏初期因病原菌侵染而產生應激反應，激發果皮木質素的合成，以此提高自身抵御能力；而在貯藏后期，由于抗病性物質木質素質量分數下降而導致西番蓮果實采后抗病性下降，從而導致果實病害大量爆發。此外，對照組西番蓮果實的果皮 總酚含量隨著采后貯藏時間的延長而不斷降低（圖3B）。以上結果表明，西番蓮果實采后病害發生與其果皮木質素、總酚等抗病物質含量下降所致果實抗病性下降有關。

進一步比較發現，與對照組果實比較，殼聚糖處理能顯著降低西番蓮采后貯藏期間的果實感病指數，保持較高的果皮木質素質量分數和總酚含量。據此認為，殼聚糖處理能通過保持較高的果皮木質素質量分數和總酚等抗病物質含量而增強果實抗病性，從而減緩西番蓮果實采后病害發生。

3.2 殼聚糖處理減緩西番蓮果實采后病害發生與抗病相關酶活力的關系

苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，在植物抗病過程中起關鍵作用。PAL、C4H和4-CL是植物苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，能促進木質素和酚類物質等抗病物質的合成[20,22]。PAL催化L-苯丙氨酸脫氨產生反式肉桂酸[23]；C4H參與合成香豆酸、咖啡酸等可直接毒殺病原物的酚酸物質；4-CL則參與主導苯丙烷的分支途徑，控制苯丙烷類化合物生物代謝向不同方向進行[24-25]。木質素是由許多苯丙烷單體聚合在一起的交聯分子，CAD是催化木質素單體合成最后一步反應的關鍵酶，能催化芥子酸、松柏醛及香豆酸還原成相應的醇[26]， CAD活力與木質素含量密切相關[19,21]。趙亞婷等[27]研究發現，采前水楊酸處理降低采后杏果實病斑直徑和發病率與其能顯著提高杏果實中PAL、C4H、4-CL等抗病相關酶活力有關。Liu Yaoyao等[28]研究報道，苯并噻二唑增強采后甜瓜抗病性、減少采后病害發生與其激活甜瓜果實中PAL、C4H等苯丙烷代謝相關酶活力有關。本實驗研究發現，與對照組西番蓮果實比較，殼聚糖處理能誘導西番蓮果皮保持較高的PAL、C4H、4-CL、CAD等抗病相關酶活力（圖4）。

PPO和POD協同催化酚類物質氧化形成對病原菌具有高毒性的醌類物質，能阻止病原菌的進一步侵入[29-30]。本課題組前期研究發現，1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）能有效提高采后‘油?’果實的PPO和POD活力，降低采后果實腐爛率[31]。楊書珍等[32]研究發現，蜂膠提取物延緩采后柑橘果實病害發生與其誘導柑橘果實PPO、POD活力增強有關。本實驗研究發現，與對照組西番蓮果實比較，殼聚糖處理能誘導西番蓮果實保持較高的果皮PPO、POD活力 （圖5）。據此認為，殼聚糖處理提高西番蓮果實采后抗病性、降低西番蓮果實采后病害發生，與其提高西番蓮果皮PPO、POD活力有關。

CHI和GLU是植物體內兩種最重要的病程相關蛋白，分別通過降解病原菌細胞壁的幾丁質和β-1,3葡聚糖而破壞病原菌的細胞結構[33]。本課題組前期研究發現，1-MCP處理能有效降低采后楊桃[23]、‘油?’[31]、臺灣青棗[34]等果實腐爛和果實病害發生，這與1-MCP處理提高采后果實CHI、GLU活力有關[23,31]。本實驗研究發現，與對照組西番蓮果實比較，殼聚糖處理能誘導西番蓮果實保持較高的果皮CHI、GLU活力（圖6）。據此認為，殼聚糖處理提高西番蓮果實采后抗病性、降低西番蓮果實采后病害發生，這與殼聚糖處理提高西番蓮果皮CHI、GLU活力，從而有利于降解導致西番蓮果實采后腐爛病原菌細胞壁的幾丁質和β-1,3葡聚糖及破壞病原菌的細胞結構有關。

綜上所述，稀釋200 倍的卡多贊溶液處理能夠增強采后西番蓮果實的自身防御系統，通過誘導PAL、C4H、4-CL、CAD、PPO和POD等抗病相關酶類活力的上升，激活苯丙烷代謝途徑，促進木質素和總酚的生成和積累，加快果實細胞壁物理屏障的形成。與對照組相比，殼聚糖處理還顯著提高了西番蓮果皮CHI和GLU活力，直接抑制西番蓮果實病原菌的生長。因此，殼聚糖處理可增強采后西番蓮果皮抗病相關酶活力以提高抗病物質的合成，進而增強果實采后抗病性，減少病害發生所引起的果實采后損傷，延長果實采后貯藏保鮮期。