褪黑素處理對草莓品質與活性氧代謝的影響

黃鴻暉，顧里娟，李美琳，鄭永華，金 鵬*

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）柔軟多汁、酸甜可口，且富含維生素、礦物質、花青素等營養成分。由于果實采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝平衡被破壞，ROS會迅速累積，從而加劇細胞膜的膜脂過氧化作用，造成細胞質膜結構損傷以及區域化分布體系被破壞，最終加速果實衰老。植物細胞內已經形成了系統的防御ROS、自由基毒害的機制[1]。現如今也已經出現了很多例如硫化氫（H2S）、外源NO、亞硝酰氫、2,4-表油菜素內酯處理等提升草莓果實采后抗氧化能力、延緩果實品質下降的保鮮措施，能夠延長草莓貨架期[2-5]。然而，H2S和NO等化學處理有可能會對人體有毒害作用，因此亟需尋求一種高效安全的保鮮措施。

近年來，褪黑素（melatonin，MT）作為一種綠色安全的保鮮物質進入研究人員的視野。MT是一種內源激素，可以在植物中或者動物的松果體中產生。現已發現，許多水果和蔬菜中都產生內源性褪黑激素，并且起著重要的作用。研究人員已經在幾種水果中檢測到褪黑激素，包括香蕉[6]、草莓[7]、蘋果[8]等。已經有文獻證明外源MT處理采后果蔬能夠維持果蔬的品質并增加其抗氧化能力，從而延長貨架期。Gao Hui等[9]研究證實褪黑激素與植物的衰老有關，他們發現MT處理能有效地減緩桃果實的衰老過程，主要體現為質量損失減少，腐爛發生率和呼吸速率降低，并保持了硬度、總可溶性固形物和抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）含量，MT處理顯著提高了兩個品種桃果實中的過氧化物酶（peroxidase，POD）與過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的活性，降低了脂氧合酶的活性，超氧陰離子自由基（O2-·）和H2O2的水平以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，表明MT處理能維持果蔬采后的品質并增加抗氧化能力。Ma Qiuxiang等[10]發現，質量濃度500 mg/L MT處理可通過直接或間接調節細胞ROS含量來延遲木薯生理退化，且銅/鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、CAT1、谷胱甘肽過氧化物酶、CAT3和谷胱甘肽S-轉移酶基因的相對表達量受MT調控而顯著提高。但是，關于MT作為采后處理保鮮劑對草莓果實采后的保鮮效果研究很少，且缺少MT處理對采后草莓的ROS代謝的系統研究，因此，本研究探索了不同濃度MT處理對草莓貯藏過程中品質和抗氧化能力的影響，并選用其最佳施用濃度處理草莓，探索其對草莓抗氧化能力的影響，為MT在草莓果實保鮮貯藏中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗中草莓品種選用‘紅顏’（Fragaria ananassaDuch.cv.Benihoppe），于江蘇省南京市鎖石生態園采摘， 并在采后2 h內運回實驗室。采摘草莓的成熟度為七成熟，單果質量約20 g，采摘時排除任何有明顯機械損傷或者病害的水果。

丙酮、乙酸、乙醇、H2O2、四氯化鈦 國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈉、硫酸、聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通（Triton X-100） 北京索萊寶科技有限公司；MT、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創木酚、水楊酸、鹽酸羥胺、二硝基苯甲酸 上海麥格林生化科技有限公司；甲硫氨酸、核黃素、氮藍四唑 上海瑞永生物科技有限公司；硫酸亞鐵 薩恩化學技術（上海）有限公司；硫代巴比妥酸、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三氯乙酸 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Minolta CR-400色度計 日本柯尼卡美能達傳感技術有限公司；14081S手持阿貝折光儀 日本Atago公司；UV-1600型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；GL-20GH冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠； DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司： FA1104電子天平 上海精密科學儀器有限公司； TA-XT2i型質構儀 英國Stable Micro System公司；DRWM型低溫人工氣候箱 寧波市江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草莓常溫保鮮實驗

將采摘后的草莓整齊排列在實驗臺上，散去田間熱。將草莓隨機分為4 組，分別用蒸餾水（對照）和100、300、500 μmol/L MT浸泡處理5 min，處理后將水果輕放在實驗臺上，并在室溫下晾干。將再將果實分裝于透明塑料盒（20 cm×12 cm×8 cm）內，每盒裝6 顆草莓，并在塑料盒外套上0.01 mm厚的聚乙烯保鮮袋。在（20±1）℃，相對濕度90%～95%的恒溫培養箱中避光貯藏6 d后取樣，檢查腐爛情況并測定腐爛指數、硬度、可溶性固形物質量分數、ASA含量。每組選用100 個果實，3 次重復。

1.3.2 低溫保鮮實驗

利用常溫保鮮實驗的結果篩選出最佳濃度進行低溫保鮮實驗，分為兩組。MT處理組：以常溫保鮮實驗獲得的最佳濃度MT浸泡草莓5 min。對照組：用蒸餾水浸泡草莓5 min。其余實驗操作與1.3.1節常溫保鮮實驗中相同，在（4±1）℃下貯藏12 d，每3 d取樣測定腐爛指數，然后用液氮速凍剩余果實，得到冷凍草莓樣品，在-80 ℃下保存備用。每組各選用300 個果實，3 次重復。

1.3.3 腐爛指數的測定

參考Aghdam等[7]的方法，將草莓腐爛程度分為5 個等級：0級：無腐爛；1級：腐爛面積占果實表面的1%～20%；2級：腐爛面積占21%～40%；3級：腐爛面積占41%～60%；4級：腐爛面積占61%～80%。根據所取樣品腐爛程度的統計結果，統計每組20 個草莓腐爛情況，重復3 次，并按式（1）計算腐爛指數。

1.3.4 硬度與可溶性固形物質量分數的測定

用TA-XT2i型質構儀測定草莓的硬度。測定參數設置：力量感應元50 N、圓柱形探頭直徑5 mm、觸發力0.5 N、下壓距離5.0 mm、下壓速率2.0 mm/s、測試速率1.0 mm/s、回程速率3.0 mm/s。重復測定10 次，單位為N。

可溶性固形物質量分數用手持阿貝折光儀測定，重復測定10 次。

1.3.5 抗壞血酸含量的測定

ASA含量的測定參考文獻[11]。以ASA為標準物質構建標準曲線，單位為 mg/100 g。

1.3.6 丙二醛、H2O2含量與O2

-·生成速率的測定

MDA含量的測定參考文獻[12]。稱取1 g 由1.3.2節獲得的草莓凍樣，加入5 mL三氯乙酸提取液研磨勻漿，低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后得到上清液備用。取2 mL上清液液于玻璃試管，加入2 mL 質量分數0.67%的硫代巴比妥酸溶液，保鮮膜封口，沸水浴20 min后冷卻并測定在450、532 nm和600 nm波長處的吸光度A450nm、A532nm、A600nm，按式（2）計算MDA含量，單位為μmol/g。

H2O2含量的測定參照文獻[13]的方法，單位為μmol/g。

O2-·生成速率的測定參照文獻[14]，單位 為nmol/（min·g）。

1.3.7 活性氧代謝相關酶活力的測定

SOD活力的測定參照文獻[15]的方法。以1 min內反應體系在560 nm波長處對氮藍四唑光化還原的抑制為50%時所需的酶量為1 個活力單位，結果以蛋白質量計，表示為U/mg。

POD活力的測定參照文獻[16]，CAT活力的測定參照文獻[17]，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參照文獻[18]，結果以蛋白質量計，表示為U/mg。

1.3.8 谷胱甘肽含量的測定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測定參考曹建康等[13]的方法。

1.3.9 自由基清除率的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測定參照文獻[19]并稍作修改。將1 g冷凍草莓樣品用5 mL 50%乙醇研磨勻漿，然后在低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后制得上清液備用。取50 μL上清液加入到2.45 μL 1.27×10－4μmol/L的DPPH-乙醇溶液中，混勻后，室溫下放置20 min，測定在517 nm波長處的吸光度A樣品，空白組以50%乙醇代替樣品，測得517 nm處吸光度A空白， 按式（3）計算DPPH自由基清除率。

ABTS陽離子自由基清除率的測定參考文獻[20]并稍作修改。ABTS陽離子自由基工作液的配制：將10 mL 8 mmol/L的ABTS與176 μL 158 mmol/L的K2S2O8混合，暗處靜置12 h以上，得到ABTS陽離子自由基母液。取1 mL母液，稀釋60 倍左右使得400 nm波長處吸光度為0.7～0.9，得到ABTS陽離子自由基工作液，現配現用。取1 g冷凍草莓樣品，加入5 mL 95%乙醇研磨勻漿，低溫離心后（12 000×g、4 ℃，20 min）取上清液備用。取3 mL ABTS陽離子自由基工作液與0.033 mL上清液混合均勻，在常溫下于暗處放置10 min，測定在734 nm波長處的吸光度A樣品，空白組以95%乙醇代替樣品，測定734 nm處的吸光度A空白，按式（4）計算ABTS陽離子自由基清除率。

羥自由基清除率測定參考文獻[21]并稍作修改。取1 g冷凍樣品，加5 mL 50%乙醇研磨至勻漿，低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后取上清液備用。反應體系為1.5 mL 0.18 mol/L的水楊酸-乙醇溶液，2 mL 0.18 mol/L的硫酸亞鐵溶液，0.02 mL 0.1% H2O2溶液，上清液0.1 mL。在510 nm波長處測定吸光度A。對照組1以50%乙醇溶液代替上清液得吸光度A0，對照組2以純乙醇溶液代替硫酸亞鐵溶液得吸光度Ax，按式（5）計算羥自由基清除率。

1.4 數據統計與分析

每個指標測定3 個平行樣，重復測定3 次。采用Origin 2018進行作圖，采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度MT處理對常溫貯藏草莓品質的影響

如表1所示，不同濃度的MT均可以延緩草莓的腐爛，300 μmol/L MT處理的草莓在6 d后的腐爛指數為44.94%，顯著低于其他處理組（P＜0.05），比對照組低39.09%。

表1 不同濃度MT處理對常溫貯藏6 d的草莓品質指標的影響Table 1 Effects of melatonin at different concentrations on the quality of strawberry stored at 20 ℃ for 6 days

硬度是判斷草莓品質的具有代表性的指標之一，且在貯藏期間草莓的硬度會有所下降。如表1所示，不同濃度的MT處理均能延緩其下降，在貯藏6 d后，300 μmol/L MT處理組草莓硬度顯著高于其他組（P＜0.05），說明此濃度處理組的貯藏效果最佳。

可溶性固形物含量可以粗略地反映草莓中糖與其他營養物質含量。在貯藏過程中，各濃度的MT處理的草莓中可溶性固形物質量分數均顯著高于對照組 （P＜0.05），但各處理組間無明顯差異（P＞0.05）。

ASA既是營養物質，又是抗氧化劑，草莓中ASA含量在貯藏期間一般呈先上升后下降的趨勢。由表1可知，不同濃度的MT處理草莓中ASA含量高于對照組，其中100、300 μmol/L MT處理組ASA含量顯著高于對照組（P＜0.05），且300 μmol/L MT處理組ASA含量最高（P＜0.05）。

因此，綜合上述結果可知，300 μmol/L為MT維持草莓品質的最佳濃度，以此濃度處理草莓，進一步驗證MT處理對草莓在低溫貯藏中的保鮮效果。

2.2 MT對低溫貯藏草莓腐爛指數的影響

如圖1所示，低溫貯藏期間草莓腐爛指數不斷上升，到貯藏后期，草莓腐爛速度加快，貯藏12 d時MT處理組腐爛指數為14.66%，而對照組為37.87%，表明MT處理能顯著抑制草莓腐爛（P＜0.05），延長草莓的保質期。

圖1 MT對草莓腐爛指數的影響Fig.1 Effect of melatonin treatment on decay index of strawberry fruit

2.3 MT對低溫貯藏草莓MDA含量、H2O2含量與O2-· 生成速率的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一，MDA的積累會對果蔬細胞造成氧化損傷，因此其含量能反映細胞膜脂過氧化程度。如圖2A所示，草莓在貯藏的12 d內， MDA含量呈現不斷上升的趨勢，可能是低溫貯藏時的冷刺激導致，貯藏6 d后MT能顯著地延緩MDA含量的 上升（P＜0.05）。

圖2 MT對草莓MDA含量（A）、H2O2含量（B）和·生成 速率（C）的影響Fig.2 Effect of melatonin treatment on MDA content (A), H2O2 content (B) and · production (C) in strawberry fruit

H2O2的積累會使得細胞膜脂質過氧化而產生損害，造成細胞衰老，但也能參與果實抗病性和抗逆性啟動的誘導過程。由圖2B可知，在整個貯藏期間，草莓中H2O2不斷積累。貯藏初期，MT處理組中的H2O2積累速度超過了對照組，但是貯藏12 d后，對照組中的H2O2含量顯著高于MT處理組（P＜0.05）。

2.4 MT對低溫貯藏草莓ROS代謝相關酶活力的影響

SOD普遍存在于植物體內，能和CAT、POD、APX等酶共同組成植物的抗氧化系統來抵抗ROS造成的損傷。如圖3A所示，貯藏期間，草莓中SOD活力呈緩慢下降趨勢，且第6 天起，MT處理組草莓SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏12 d時，MT處理組的SOD活力比對照組高5.45%。POD作為ROS代謝中重要的酶存在于 果蔬之中。貯藏期間POD活力呈先上升后下降趨勢 （圖3B），MT處理促進草莓貯藏前期POD活力的上升，并延緩其貯藏后期活力的下降，貯藏期間MT處理組POD活力顯著高于對照組（P＜0.05），在貯藏12 d時，MT處理組的POD活力比對照組高28.75%。如圖3C所示，在草莓貯藏前3 d，CAT活力上升，隨后持續下降，貯藏6 d后，MT處理組CAT活力顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖3D所示，草莓APX活力在貯藏期間呈先上升后下降趨勢，貯藏期間MT處理組APX活力均顯著高于對照組（P＜0.05），兩組草莓均在貯藏6 d出現峰值，且MT處理組中APX活力峰值是對照組中的1.24 倍。

圖3 MT處理對草莓SOD（A）、POD（B）、CAT（C）、 APX（D）活力的影響Fig.3 Effect of melatonin treatment on SOD (A), POD (B), CAT (C) and APX (D) activities in strawberry fruit

2.5 MT對低溫貯藏草莓GSH含量和ASA含量的影響

GSH可以在植物代謝循環中作為還原劑，能在脫氫ASA還原酶的作用下將脫氫ASA還原成還原型ASA，而還原型ASA能直接清除H2O2。如圖4A所示，草莓GSH含量在貯藏期間先增高后降低，從第6天開始，MT處理組中GSH含量一直顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏12 d時比對照組高14.42%，說明MT能延緩GSH含量的下降，維持草莓的抗氧化能力。由圖4B可知，草莓中ASA含量在貯藏期間先上升后下降，貯藏3 d后，MT處理表現出延緩草莓ASA含量下降的能力，且在9 d后其ASA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖4 MT處理對草莓GSH（A）和ASA（B）含量的影響Fig.4 Effect of melatonin treatment on GSH (A) and ASA (B) contents in strawberry fruit

2.6 MT對低溫貯藏草莓自由基清除率的影響

DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和羥自由基清除率均直觀地展現了果實抗氧化能力，自由基清除率越高表示草莓的抗氧化能力越強。圖5A中，草莓DPPH自由基清除率先上升迅速后趨于緩慢，從第6天開始，處理組的DPPH自由基清除率就顯著高于對照組（P＜0.05），在貯藏末期，MT處理組的DPPH自由基清除率為52.34%，是對照組的1.09 倍。由圖5B可知，兩組草莓ABTS陽離子自由基清除率逐漸增加，其中對照組由貯藏0 d時的54.87%逐步增長至12 d時的69.56%，而MT處理組在第12天時則為74.73%，且貯藏9、12 d時，MT處理組ABTS陽離子自由基清除率顯著高于對照組 （P＜0.05）。如圖5C所示，隨著草莓貯藏時間的延長，其羥自由基清除率呈現總體上升的趨勢，且MT處理組在貯藏6 d時開始顯著高于對照組（P＜0.05），至貯藏12 d時，MT處理組的羥自由基清除率是對照組的1.10 倍。由此說明，外源MT能顯著增加草莓的自由基清除能力，提升草莓抗氧化能力以維持細胞膜完整性。

圖5 MT處理對草莓DPPH自由基清除率（A）、ABTS陽離子 自由基清除率（B）和羥自由基清除率（C）的影響Fig.5 Effect of melatonin treatment on scavenging capacity of strawberry fruit against DPPH radicals (A), ABTS cation radicals (B) and hydroxyl radicals (C)

3 討 論

由于草莓采后代謝活動尚未停止，衰老與外界脅迫均會促使細胞中過量的自由基引發膜脂質過氧化作用，引起果實品質下降[22-23]。本研究中利用不同濃度的MT處理草莓，在20 ℃貯藏6 d后，300 μmol/L MT可以顯著降低草莓腐爛指數，延緩硬度和可溶性固形物質量的下降并維持ASA含量。這與王晶等[24]的報道結果相似，即外源MT能夠提升柑橘果實的新鮮度和ASA含量，并提高可溶性固形物含量和果實風味。此外，千春錄等[25]發現MT處理后的水蜜桃，其在貯藏過程中的硬度下降、質量損失率上升以及冷害癥狀均被抑制，從而維持了感官品質。

SOD、CAT、APX、POD 4 種酶均是植物酶促防御系統中主要的代謝酶[27]。本實驗探究了在所篩選濃度下，MT對草莓貯藏期間SOD、POD、CAT、APX活力產生的影響，發現MT在貯藏后期對SOD活力的維持效果十分顯著，而對POD、CAT和APX的影響則主要體現在提升貯藏前期酶活力并延緩貯藏后期酶活力下降，這可能與H2O2含量因果實受到MT處理而出現迸發有關，即酶促防御系統在貯藏初期受到了誘導強化，而后相對較高的抗氧化酶活力導致貯藏后期中MT處理組相對較低的ROS含量。

ASA與GSH等抗氧化物質在清除ROS的非酶促防御系統中十分重要。ASA與GSH不僅能直接將ROS還原，還可以通過與抗氧化酶類（例如GSH還原酶和脫氫ASA還原酶）共同發揮作用，參與對ROS的清除。本研究發現，貯藏過程中GSH與ASA含量的降低也會被MT延緩，這或許與MT也是一種強抗氧化劑有關，MT可以直接參與自由基清除的過程[28]，從而延緩GSH與ASA的氧化消耗，維持ASA-GSH循環的穩定性與還原能力。自由基的清除速率能直觀地展示果蔬的抗氧化能力的變化，本研究發現，與對照組相比，MT對草莓DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率的提升效果十分顯著，隨著貯藏時間的延長，這種效果愈加明顯，這可能與MT對草莓中酶促與非酶促防御系統的促進作用有關，MT對二者的促進作用直接和間接地提高了草莓果實的抗氧化能力，使MT處理組果實清除各自由基的能力均有顯著提升。

綜上所述，MT增加草莓貯藏期間的抗氧化能力，主要體現在其對草莓酶促防御系統和非酶促防御系統的能力提升上。這與朱玲玲等[29]發現用MT處理降低了青花菜中·和H2O2積累的結果相似，而且SOD、CAT和POD活力也同時增加，表明褪黑激素可以通過調節呼吸代謝和抗氧化活力來延遲西蘭花收獲后的衰老過程。另外，Hu Wei等[30]發現外源MT可通過降低H2O2含量來提高CAT和POD的活力，顯著延遲木薯塊根的生理性變質，還通過激活ROS清除和ROS信號轉導途徑起作用。

4 結 論

本研究通過對MT處理草莓貯藏期間腐爛指數以及品質指標的測定，確定MT對草莓的品質具有維持作用，并篩選獲得了300 μmol/L的最佳濃度，然后用300 μmol/L的MT處理草莓并低溫貯藏。結果發現，MT處理能降低草莓MDA與H2O2的積累，抑制O2-·生成速率的上升，維持ROS代謝相關酶（SOD、POD、CAT、APX）的活力并延緩GSH與ASA含量的下降，說明MT能增加草莓采后的抗氧化能力，減少氧化損傷，而ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率的提升則更直觀地展示了MT對草莓抗氧化能力的提升效果。綜上所述，MT處理能降低草莓貯藏期間的腐爛程度，延緩膜脂過氧化，延長保質期。