米糠粕不溶性膳食纖維理化性質及對高脂 大鼠腸道菌群的影響

劉 倩，范譽川，劉素詩，趙潔羽，魏 濤,*

（1.北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

現代飲食習慣通常會造成脂肪和糖的過量攝入，從而引起肥胖、高脂血癥等疾病。高脂血癥除造成血漿中膽固醇和（或）甘油三酯水平升高外，通常還會使腸道菌群發生顯著改變[1-3]。膳食纖維是指天然存在于水果、蔬菜、谷類等食品中的一類不能被人體消化道酶解吸收的營養物質，在控制體質量、緩解高脂血癥、預防結腸癌和心腦血管疾病等方面具有重要應用[4-6]。美國飲食協會建議每天膳食纖維攝入量女性約為25 g，男性約為38 g[7]；Reynolds等建議人們應將膳食纖維的攝入量增加到每天至少25～29 g，并認為更多的攝入量可能會帶來額外的益生作用[8]。而目前全球大多數人每日膳食纖維攝入量不足20 g，2016年中國醫藥生物技術協會膳食纖維分會發布的《中國居民膳食纖維攝入白皮書》顯示，中國居民膳食纖維攝入普遍不足，每日人均膳食纖維（不可溶）攝入量僅為11 g；因此開發膳食纖維產品、提高我國居民膳食纖維攝入水平具有重要意義。米糠和米糠粕是稻米及其相關產品加工過程中的副產物，我國是水稻種植大國，2019年全國稻谷產量為20 961萬 t，按出糠率12%計算，則可產出約2 515萬 t米糠。米糠原材料分布廣、產量大、膳食纖維含量豐富，可作為膳食纖維的良好來源。

根據水溶性的不同，膳食纖維可分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維，不溶性膳食纖維主要包括纖維素、半纖維素和木質素等，通常認為不溶性膳食纖維可通過增加糞便體積、刺激腸道蠕動、增加排便量等方式發揮生理活性[9-10]。近年來的一些研究結果表明，不溶性膳食纖維還可被腸道微生物發酵利用，Sun Shanshan等發現不溶性的茯苓多糖能夠使小鼠腸道中產丁酸菌Lachnospiracea和Clostridium豐度增加，提高腸道中丁酸鹽水平和黏膜完整性，激活腸道過氧化物酶體增殖物激活受體γ通路[11]；Yang Lina等通過體外發酵分析發現大豆殼不溶性膳食纖維能夠增加雙歧桿菌和乳桿菌豐度[12]；Wu Weijie等發現箭竹不溶性膳食纖維能夠提高雙歧桿菌豐度，并使總短鏈脂肪酸的含量增加0.71 倍[13]。不溶性膳食纖維攝入可影響腸道菌群的組成和代謝，通過更加復雜的方式發揮調節作用，而目前關于米糠粕不溶性膳食纖維（rice bran insoluble dietary fibers，RBIDF）對腸道菌群的影響缺乏相關研究。

本實驗以米糠粕為原料，通過多種酶結合處理的方式制備RBIDF，對其表面結構、常規成分和理化性質進行研究，此外建立高脂大鼠模型，分析RBIDF干預對高脂大鼠腸道菌群的影響，以期為RBIDF的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠粕 鄭州四維糧油工程技術有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/g）、α-1,4-葡萄糖苷酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）和纖維素酶（50 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、膽固醇 生工生物工程上海股份有限公司；Gene JETTMGel Extraction Kit試劑盒 美國Thermo Scientific公司；甘油三酯、總膽固醇測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

SU-8010掃描電子顯微鏡、L-8800氨基酸分析儀 日本 日立公司；SER148脂肪萃取儀 意大利VELP公司；DR-200BS酶標分析儀 無錫華衛德朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RBIDF的制備

取一定量米糠粕，按料液比1∶20加水攪攔混勻，添加1%（以米糠粕質量計，下同）的淀粉酶和0.4%的糖化酶，混勻并于60 ℃下酶解2 h，后置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后，加1%的木瓜蛋白酶酶解2 h，再置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后加入1%的纖維素酶于60 ℃下酶解1 h，后置于沸水浴中滅酶10 min，離心去掉上清液，沉淀用蒸餾水和體積分數95%乙醇溶液各洗滌1 次，隨后在60 ℃下干燥，粉碎后過60 目標準篩備用。

1.3.2 RBIDF表面結構觀察

將樣品干燥至恒質量，取樣品若干，置于粘有銅片的觀察臺上，樣品粘臺后噴金，通過掃描電子顯微鏡于10 kV下觀察表面超微結構。

1.3.3 RBIDF常規成分和理化性質分析

水分質量分數參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法測定；脂肪質量分數參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測定；蛋白質量分數參照 GB/T 31578—2015《糧油檢驗 糧食及制品中粗蛋白測定 杜馬斯燃燒法》測定；灰分質量分數參照GB 5009.4—2016 《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》測定；不溶性膳食纖維質量分數參照GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》中酶重量法測定；氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》測定。碳水化合物質量分數參照GB 28050—2011《預包裝食品營養標簽通則》測定，按照公式（1）計算。

持水力采用Sangnark等的方法[14]，將3 g樣品和100 mL去離子水放入燒杯中混勻，靜置2 h后離心去上清液，稱量樣品的濕質量。持水力按公式（2）計算。

持油力參照Sangnark等的方法[14]，取3 g樣品置于離心管中，加入24 g食用花生油，37 ℃靜置1 h，離心去掉上層油，再用吸油紙吸干游離花生油，稱量剩余樣品的質量。持油力按公式（3）計算。

1.3.4 RBIDF吸附能力測定

分析RBIDF對葡萄糖和膽固醇的吸附能力。吸附量以每克樣品吸收的底物質量表示，單位mg/g。吸附率按式（4）計算。

葡萄糖吸附能力測定：稱取1 g樣品與100 mL的葡萄糖溶液（0.1、0.2、0.3 mg/mL）混勻，置于37 ℃、180 r/min 搖床中分別吸附0.5、1、2、4 h，分別離心取上清液，采用3,5-二硝基水楊酸法測上清液中葡萄糖的質量。

膽固醇吸附能力測定：在pH 2.0和pH 7.0的條件下將1 g樣品與50 mL的膽固醇溶液（40 mg/mL）混勻，于37 ℃、180 r/min下分別吸附0.5、1、1.5、2、3 h，離心取上清液，采用Liu Chun等的方法測上清液中膽固醇的質量[15]。

1.3.5 RBIDF體外抗氧化能力測定

參考Sarfaraz等的方法[16]，將0.3 g的RBIDF樣品與10 mL、體積分數50%丙酮溶液混勻后在室溫下振蕩16 h，隨后10 000 r/min離心10 min，取上清液測其體外抗氧化能力。DPPH自由基和羥自由基清除能力測定參照Liu Qian等的方法[17]進行，配制相應質量濃度（1.875～60 mg/mL）的VC溶液作為陽性對照。

1.3.6 動物實驗

選擇體質量在140～160 g的成年雄性SD大鼠，適應性飼養7 d后，飼喂高脂飼料4 周建立高脂血癥模型，采用試劑盒檢測大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平，然后依據甘油三酯水平隨機分為2 組，即高脂模型組（MC組）和RBIDF干預組（RBIDF組），MC組喂養高脂飼料（飼料配方如表1所示），RBIDF組除喂養高脂飼料外每日按3.5 g/kgmb灌胃RBIDF，每組6 只大鼠。灌胃干預4 周，另設正常對照組（NC組）喂養基礎飼料。灌胃結束后麻醉處死解剖，迅速收集大鼠盲腸內容物至無菌離心管中，-80 ℃冰箱中保存備用。

表1 動物飼料配方Table 1 Nutrient composition of experimental diets

1.3.7 腸道菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法從大鼠盲腸內容物中提取細菌DNA，對16S rDNA的V3～V4可變區進行擴增，使用的通用引物為F431（5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′）和R806（5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′）。利用Gene JETTMGel Extraction Kit試劑盒對產物進行回收，構建文庫，利用Ion S5TMΧL平臺進行高通量測序。測序和分析方法參考文獻[18]。

1.4 數據統計與分析

實驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 19軟件對實驗結果進行統計分析，組間差異用單因素方差分析法分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 RBIDF表面結構觀察結果

利用掃描電子顯微鏡對米糠粕和RBIDF的表面形貌進行觀察，如圖1A所示，米糠粕的表面結構較為光滑緊密，沒有空隙和孔洞，附著有大量的球狀顆粒，應為表面包裹的淀粉和蛋白質。而經過淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和纖維素酶處理后，淀粉和蛋白質發生水解，獲得的RBIDF表面幾乎不具有球狀淀粉顆粒，呈不規則鱗片式的層狀疏松結構，并有明顯的裂縫及孔洞（圖1B），說明RBIDF與米糠粕相比比表面積有所增大，利于提高其吸附性能。

圖1 米糠粕（A）和RBIDF（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopic images of defatted rice bran (A) and RBIDF (B)

2.2 RBIDF常規成分和理化性質分析結果

對米糠粕和RBIDF的灰分、蛋白質、脂肪、不溶性膳食纖維和氨基酸組成等指標進行分析。由表2、3可知，RBIDF中蛋白質、脂肪質量分數和各氨基酸含量（除甲硫氨酸）與米糠粕相比顯著下降，而不溶性膳食纖維質量分數顯著提高（P＜0.05），達到64.26%，這可能是RBIDF制備過程中淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的處理可以使米糠粕中的可溶性淀粉和蛋白質發生水解，煮沸處理可提取出米糠粕中殘余的部分脂肪所致。此外，持水力和持油力分析結果表明，RBIDF的持水力和持油力與米糠粕相比顯著提高，分別可達5.86 g/g和2.86 g/g，這可能是由于處理后RBIDF的表面結構與米糠粕相比更為疏松多孔，比表面積增大。

表2 米糠粕和RBIDF常規成分和理化性質Table 2 Chemical compositions and physicochemical properties of defatted rice bran and RBIDF

表3 米糠粕和RBIDF氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of defatted rice bran and RBIDF

2.3 RBIDF吸附能力分析結果

如圖2A所示，在相同葡萄糖質量濃度下，隨著吸附時間延長，RBIDF的吸附率變化較小并逐漸趨于穩定，說明RBIDF對葡萄糖的吸附較為迅速，吸附量最高為6.4 mg/g，穩定后總體在4.0 mg/g以上，良好的葡萄糖吸附能力說明RBIDF在減少葡萄糖吸收、調節血糖水平方面具有一定的應用潛力。許多疾病與體內膽固醇的含量直接相關，人體中的膽固醇主要來源于外源性攝入和內源性合成，因此，防止過量攝入以及保持正常的膽固醇水平有利于人體健康。如圖2B所示，對RBIDF的膽固醇吸附能力進行分析，設置反應pH值分別為2.0和7.0來模擬胃腸道 消化環境，結果表明，在較短的吸附時間內，pH 7.0條件下RBIDF的膽固醇吸附能力要優于pH 2.0，吸附1 h時膽固醇吸附量最高，為12.8 mg/g，而隨著吸附時間的繼續延長（1～3 h），中性條件下的吸附量有所下降，而酸性條件下吸附量有所提高，吸附2 h時兩種條件下膽固醇吸附量都達到9.0 mg/g左右，綜上，RBIDF在中性和酸性條件下都表現出一定的膽固醇吸附能力。

圖2 RBIDF對葡萄糖（A）和膽固醇（B）的吸附能力Fig.2 Glucose (A) and cholesterol (B) adsorption capacity of RBIDF

2.4 RBIDF抗氧化能力分析結果

研究表明米糠中含有豐富的酚類化合物，具有抗氧化、抗炎等多種生物活性，其中以共價鍵結合在纖維素分子上的不溶性酚類化合物是其主要的存在形式[19-20]。如圖3所示，RBIDF對羥自由基的清除率最高可達70.1%，對DPPH自由基的清除率隨著檢測質量濃度增大而升高，60 mg/mL時 約為72.1%。RBIDF表現出良好的抗氧化性，攝入RBIDF對于維持腸道正常氧化還原狀態具有一定的有益效果。

圖3 RBIDF對羥自由基和DPPH自由基的清除率Fig.3 Hydroxyl and DPPH free radical scavenging capacity of RBIDF

2.5 RBIDF對高脂大鼠腸道菌群的影響

以往的許多研究已經表明，不溶性膳食纖維在控制高脂大鼠體質量、緩解高脂血癥方面具有一定的作用，近年來發現不溶性膳食對于腸道菌群也會產生一定的影響[11-12,21-22]，因此對RBIDF灌胃前后高脂大鼠腸道菌群變化進行了分析。首先建立大鼠高脂模型，如表4所示，喂養高脂飼料4 周后，MC組與NC組相比，血清甘油三酯和總膽固醇濃度顯著提高（P＜0.05），說明大鼠高脂模型造模成功。灌胃RBIDF后提取大鼠盲腸內容物細菌DNA，利用IonS5TMΧL測序平臺進行測序，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），共得到872 個OTUs，然后根據Silva132數據庫對OTUs進行物種注釋。如圖4A所示，對OTUs結果進行Venn圖分析，NC組具有687 個OTUs，而高脂模型MC組有581 個OTUs，與NC組相比有所減少，說明高脂飲食在一定程度上降低了動物腸道菌群多樣性；RBIDF組含有604 個OTUs，與MC組相比OTUs數量有所恢復。在組成上，與MC組相比，RBIDF組產生162 個特有OTUs，與NC組相比只產生了93 個特有OTUs，說明在菌群組成上RBIDF組與NC組更為接近。

表4 高脂飼料對大鼠血脂水平的影響Table 4 Effect of high-fat diet on serum lipid levels in rats

根據物種注釋結果，選取每組在門水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，如圖4B所示。NC組中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要物種，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中的兩個主要群落，可影響代謝平衡，兩者含量和比例可作為判斷潛在肥胖可能性的依據，許多研究表明，缺乏膳食纖維、高脂高糖的飲食會引起腸道中厚壁菌門豐度升高，擬桿菌門豐度降低[23-24]。因此，MC組擬桿菌門豐度與NC組相比都有所下降，而RBIDF組與MC組相比擬桿菌門豐度有所恢復，說明在門水平上RBIDF能在一定程度上改善菌群紊亂。如圖4C所示，在屬水平上，與NC組相比，MC組Blautia相對豐度提高，Lactobacillus、Romboutsia、unidentified_Lachnospiraceae、unidentified_Ruminococcaceae和Roseburia相對豐度有所下降，上述幾種微生物與人體健康有重要的關系，有研究發現，非酒精性脂肪肝患者腸道中Blautia豐度與正常人相比有所提高[25]， 而Lactobacillus、Roseburia和Ruminococcaceae等微生物的豐度與短鏈脂肪酸的產生或者防止心腦血管病變等成正相關[26-29]。而RBIDF干預后，與MC組相比，RBIDF組Romboutsia和unidentified_Lachnospiraceae相對豐度下降，Lactobacillus和Roseburia相對豐度無明顯變化，而與短鏈脂肪酸產生相關的Butyricicoccus、Marvinbryantia和unidentified_Ruminococcaceae的相對豐度有所上升（圖4C）。根據所有樣本的物種注釋結果和OTUs的豐度信息，基于Unweighted Unifrac距離進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖分析，樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似。如圖4D所示，NC組與MC組各樣本距離較遠，而RBIDF組處于兩組之間的位置，表明其與NC組的物種組成結構相似度與MC組相比有所提高，說明RBIDF對高脂膳食造成的腸道微生物群落組成變化具有一定的恢復作用。

圖4 各實驗組大鼠腸道菌群組成Fig.4 Gut microbiota composition in different groups of rats

3 結 論

米糠及米糠粕中不溶性膳食纖維含量豐富，本實驗利用酶處理等方式制備RBIDF，對其理化性質及對高脂大鼠腸道菌群的影響進行了分析。結果表明，RBIDF不溶性膳食纖維與米糠粕相比結構更為疏松多孔，比表面積增大，具有良好的持油力、持水力以及葡萄糖和膽固醇吸附能力，并且還表現出較好的抗氧化性。此外，灌胃RBIDF能夠在一定程度上改善高脂膳食造成的大鼠腸道微生物數量和組成變化，提高與短鏈脂肪酸產生相關的Butyricicoccus、Marvinbryantia和unidentified_Ruminococcaceae豐度。RBIDF表現出較好的體內體外活性，可作為膳食纖維的良好來源。本研究為開發RBIDF及其作用機理探索提供了理論參考。