乳酸菌發酵胡柚汁對小鼠肥胖的調節作用

顏 旭，王方杰，吳祖芳,*，翁佩芳

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211；2.浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

隨著人們飲食觀念的改變和自我保健意識的增強，通過飲食調整促進自身健康的觀念逐漸得到認同，綠色、天然、營養和保健成為人們選擇食品的重要指標。益生菌發酵果蔬汁產品恰好迎合了現代人的需求，顯示出較好的發展勢頭[1-2]。經過發酵，果蔬汁產品被賦予獨特風味，產生了豐富的乳酸、氨基酸和短鏈脂肪酸等多種營養物質，賦予果蔬新的營養功能[3]。有研究報道，一種用乳酸菌發酵的果汁能夠顯著降低大鼠血液中膽固醇含量，可能是其中的乳酸菌在發酵過程中產生了一些活性物質所致[4]。發酵果蔬汁還有抗疲勞作用，同時還可以緩解腹瀉對小鼠腸道黏膜的損傷，加強小鼠腸道屏障的防御功能[5]。

常山胡柚（Citrus paradisicv.Changshanhuyou）又名胡柚、金柚，是原產浙江省常山縣的地方柑橘品種，是蕓香科柑橘屬的一個種，為酸橙與柚雜交的地方柑橘品種，僅浙江常山區目前年產量就達10萬余噸，且種植面積還在不斷擴大。胡柚果實因富含多種生物活性物質、具有較高的保健藥用功能而受到廣泛的關注[6-7]。經乳酸菌發酵后，發酵胡柚汁（fermented Huyou juice，FHJ）的揮發性風味化合物種類增加[8]；有機酸含量變化顯著，總酚和總黃酮類化合物含量提高，自由基清除能力提高，顯著改善了胡柚汁的品質和抗氧化特性[9]。目前，對益生菌FHJ的研究更多集中在加工工藝和品質方面，對其功能性的研究則鮮見報道。

為研究乳酸菌發酵胡柚汁對小鼠肥胖的調節作用，本實驗利用C57/BL6J小鼠開展動物實驗，通過飼喂高脂飼料誘導產生肥胖癥狀從而建立肥胖小鼠模型，并對肥胖小鼠進行FHJ飲食干預，通過考察小鼠的各項生理生化指標和組織中脂肪積累情況，研究乳酸菌FHJ對肥胖小鼠的降脂作用，為乳酸菌FHJ功能性評價和減肥機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級C57BL/6J小鼠（6 周齡，雄性，平均體質量（20±2）g）購于上海斯萊克實驗動物有限公司（生產許可證號：SCΧK（滬）2017-0005）。

低脂（對照）飼料（TP23402，脂肪提供10%能量）、高脂飼料（TP23400，脂肪提供60%能量）購于南通特洛菲飼料科技有限公司，飼料主要成分見表1。

表1 高脂飼料和低脂飼料熱量及成分Table 1 Calories and ingredients of high-fat and low-fat diets

新鮮胡柚購自浙江省常山縣胡柚種植基地；植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarumL1）、發酵乳桿菌L2（Lactobacillus fermentumL2）由寧波大學食品與藥學學院食品生物技術實驗室保存。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染液、油紅O染液、脂肪固定液 武漢谷歌生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、異丙醇、無水乙醇、鹽酸、多聚甲醛 國藥集團有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AY-120型電子精密天平 日本Shimadzu公司； LDZΧ-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠； HH-4型恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；Spectramax190全波長酶標儀 美國Molecular Devices有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MΧ-S/MΧ-F型漩渦混合器 大龍興創實驗儀器北京有限公司；JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 徠卡（上海）儀器有限公司；KD-P組織攤片機 金華市科迪儀器設備有限 公司；DHG-9140A烤箱 上海慧泰儀器制造有限公司；Cryotome E冰凍切片機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Eclipse CI正置光學顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發酵胡柚汁的制備

將新鮮胡柚進行清洗，去除果皮、囊衣和籽等不可食用部分，得到胡柚果肉。將果肉加水榨汁，過濾去渣后獲得胡柚果汁。加入體系質量8%的白砂糖并攪攔均勻，在85 ℃下巴氏滅菌20 min，冷卻至25 ℃。隨后，將胡柚汁按照總體積的3%接種植物乳桿菌L1和發酵乳桿菌L2混合發酵劑（質量比為1∶1），接種后的果汁在37 ℃下發酵36 h，然后在4 ℃冰箱中靜態放置12 h后熟，得到FHJ[9]。在相同條件下不進行接種作為對照，得到未發酵胡柚汁（non-fermented Huyou juice，NFHJ）。在動物實驗開始前測定果汁中的活菌數，FHJ中的活菌數約為 109CFU/mL，而在NFHJ中未發現活菌。所得樣品置于4 ℃下儲存備用。

1.3.2 動物飼養條件及實驗分組

在整個實驗期間，所有涉及動物的實驗程序均嚴格按照中國有關實驗動物的使用和飼養規定在寧波大學實驗動物中心進行（使用許可證號：SYΧK（浙）2013-0191）。 購得的小鼠經外包裝滅菌處理立即放入動物房SPF級屏障系統內飼養，飼養環境溫度22～24 ℃、相對濕度（50±10）%，光暗循環周期為12 h。小鼠在實驗期間可以自由獲得食物和水，墊料每3 d更換一次。

小鼠以高脂飲食適應性飼養7 d，然后均分為4 組，每組8 只小鼠：低脂飲食組（LFD組，飼喂低脂飼料， 灌胃10 mL/（kgmb·d）無菌水）（對照）、高脂飲食組（HFD組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）無菌水）、高脂飲食+FHJ組（FHJ組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）FHJ），高脂飲食+NFHJ組（NFHJ組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）NFHJ）。根據人類肥胖和超重標準，將肥胖度大于10%視為超重，大于20%視為肥胖并認為肥胖模型建立成功。肥胖度按公式（1）計算[10-11]。實驗以第一天灌胃記為第0周，共持續8 周，每周記錄3 次小鼠的體質量和飲食量、飲水量并計算平均值。

1.3.3 小鼠臟器指標分析

第8周末，所有小鼠禁食過夜，通過頸椎脫臼處死小鼠，立即收集血液樣本，放入EP管中，4 ℃靜置30 min，再3 500 r/min離心10 min。取上層血清于干凈的離心管中，分裝3 管，置于4 ℃冰箱保存備用。迅速解剖小鼠，對小鼠的肝臟、心臟、腎臟、脾臟、附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪進行稱質量。按式（2）計算小鼠的肥胖指數，即白色脂肪（附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪）質量與體質量的百分比。按式（3）計算小鼠各臟器指數。

稱質量后，將新鮮肝臟組織用預冷PBS沖洗干凈，取肝臟最大面，切成1 cm×1 cm×1.5 cm大小，置于體積分數4%多聚甲醛溶液中用于組織切片分析。剩余肝臟組織用于抗氧化指標的測定。將脂肪組織用預冷PBS沖洗干凈，取附睪脂肪置于體積分數4%多聚甲醛溶液中。

1.3.4 血清生化指標和肝臟抗氧化指標的測定

小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C濃度及ALT、AST活力均采用相應試劑盒進行檢測，測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

取小鼠肝臟組織準確稱質量，放入5 mL的勻漿管中，加入9 倍體積的勻漿介質PBS，冰水浴條件下用眼科小剪盡快剪碎組織塊。將上述組織勻漿液2 500 r/min離心10～15 min，取上清液進行測定。小鼠肝臟中MDA含量和SOD、GSH-Px活力均采用相應試劑盒進行檢測，測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 組織切片分析

將新鮮肝臟組織在體積分數4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用OTC包埋劑進行包埋。快速冷凍后切下組織切片（8～10 μm），并用油紅O染色，在光學顯微鏡下放大200 倍觀察肝臟脂肪變性程度。

附睪脂肪在體積分數4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用一系列體積分數乙醇溶液（50%、70%、85%、90%、95%、100%、100%，各1 h）依次脫水，并包埋在石蠟中。切下組織切片（5～6 μm），并用蘇木精-伊紅染色。通過顯微鏡放大200 倍獲得圖像。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均進行3 次平行，數據結果表示為平均值± 標準差。運用統計軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗，當P＜0.05時認為具有統計學顯著差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠飲食量、飲水量、體質量和臟器質量的變化

由圖1可知，各組小鼠的日均飲食量和飲水量在實驗周期內基本穩定，在8 周的實驗周期內飲食量保持在3.5～6.0 g，LFD組、HFD組、FHJ組和NFHJ組小鼠的飲食量無明顯差異；LFD組小鼠的飲水量整體高于HFD組，其他組的飲水量無明顯差異，保持在每天5.0～7.3 mL。結果證明FHJ和NFHJ的攝入不會引起小鼠的食欲下降。

圖1 FHJ灌胃期間小鼠日飲食量（A）和飲水量（B）的變化Fig.1 Changes in daily food intake (A) and water intake (B) of mice during administration of FHJ

對8 周實驗期間各組小鼠的平均體質量進行比較。第0周時，模型小鼠的初始平均體質量為20.0 g。隨著實驗的進行，小鼠體質量呈現整體上升趨勢。C57BL/6J肥胖小鼠模型建立成功的判斷標準是高脂飲食組平均體質量高于對照組20%。由圖2A可知，經過8 周的高脂飲食誘導，HFD組小鼠平均體質量是LFD組小鼠體質量的1.28 倍，具有極顯著差異（P＜0.01），證明肥胖模型誘導成功。在FHJ和NFHJ的灌胃干預下，與HFD組相比，干預組小鼠的體質量呈現不同程度的下降。從第4周起，FHJ組的平均體質量顯著低于HFD組（P＜0.05），第7周起具有極顯著差異（P＜0.01）。而NFHJ組小鼠的體質量從第7周開始顯著低于HFD組（P＜0.05）。

圖2 FHJ灌胃期間小鼠體質量變化Fig.2 Changes in body mass of mice during administration of FHJ

由圖2B可知，至第8周實驗結束時，HFD組的體質量增量最多，為（11.45±0.65）g，與LFD組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。FHJ組的平均體質量增量為（6.49±0.32）g，與HFD組體質量增量相比極顯著降低 （P＜0.01）。NFHJ組的平均體質量增量為 （8.34±0.37）g，與HFD組相比顯著降低（P＜0.05）。實驗結果表明，FHJ、NFHJ顯著緩解了肥胖小鼠的體質量增加，且FHJ的效果更好。

如表2所示，灌胃8 周后，HFD組小鼠的肝臟質量為（1.12±0.25）g，相比LFD組顯著增大（P＜0.05），FHJ組和NFHJ組小鼠的肝臟質量基本恢復至正常水平，由表3可知，與LFD組相比，其他3 組小鼠各個臟器指數均較低，這是因為HFD組的脂肪質量增量占體質量增量的比重更大，從而導致臟器指數的降低。各組小鼠的臟器脂肪質量具有明顯差異，FHJ組和NFHJ組小鼠的附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪質量均低于HFD組，經胡柚汁干預后，肥胖小鼠的白色脂肪總質量由HFD組的（2.73±0.25）g顯著降低至FHJ組的（1.32±0.13）g （P＜0.05）以及NFHJ組的（2.16±0.12）g （P＜0.05）。由圖3可知，HFD組小鼠的肥胖指數高達（8.72±0.26）%，與LFD組相比具有極顯著差異 （P＜0.01），FHJ和NFHJ的攝入顯著降低了小鼠的肥胖指數（P＜0.05）。因此，FHJ和NFHJ能夠在一定程度上減少肥胖小鼠體內脂肪的累積。

表2 不同飲食對小鼠臟器質量的影響Table 2 Effects of different diets on visceral organ masses of mice

表3 不同飲食對小鼠臟器指數的影響Table 3 Effects of different diets on visceral organ indexes of mice

圖3 不同飲食小鼠的肥胖指數Fig.3 Obesity indexes of mice consuming different diets

2.2 小鼠血清生化指標分析結果

由表4可知，與LFD組相比，HFD組小鼠的TC、TG和LDL-C濃度顯著升高，HDL-C濃度顯著下降 （P＜0.05），肥胖小鼠出現高血脂癥狀；同時HFD組小鼠的AST和ALT活力也顯著升高，分別達到了（185.40±8.19）U/L和（109.50±5.08）U/L，證明長期高脂膳食對小鼠肝臟造成了一定的損傷。灌胃FHJ和NFHJ后，FHJ、NFHJ組與HFD組相比較，TC、TG和LDL-C濃度總體顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），其中TG和LDL-C濃度基本恢復至正常水平；AST和ALT活力也在FHJ和NFHJ的作用下明顯降低，其中FHJ組的這兩項指標分別降低至（156.70±8.17）U/L和（67.80±7.71）U/L， NFHJ組這兩項指標分別降低至（169.10±9.23）U/L和（78.40±6.71）U/L。實驗結果表明，FHJ和NFHJ的攝入能夠顯著降低肥胖小鼠的血脂水平，在一定程度上減輕長期高脂飲食造成的肝臟損傷，并且FHJ的效果 優于NFHJ。

表4 FHJ和NFHJ灌胃對小鼠血清生化指標的影響Table 4 Effects of FHJ and NFHJ on serum biochemical parameters in mice

在肥胖狀態下，宿主會將體內非酯化的脂肪酸釋放到循環系統中并在體內循環，從而提高TG水平，降低HDL-C水平，使血脂組成向LDL-C轉變，增加動脈粥樣硬化的風險[12]。而補充益生菌或益生元可以改善肥胖或超重人群的脂代謝，尤其能夠顯著降低TC和LDL-C水平[13-14]。這些觀點可解釋含大量活性乳桿菌的FHJ比NFHJ對血脂水平的調節作用更好。脂肪肝的形成與炎癥反應增強有關，AST和ALT活力在肥胖脂肪肝形成早期會顯著升高[15-16]。已有研究報道，某些乳桿菌能夠通過降低血清中的TG水平和AST、ALT活力顯著抑制小鼠的肥胖發展和脂質沉積[17]。FHJ的干預有效緩解了HFD小鼠肝臟的損傷，對脂肪肝及肝臟病變起到了積極的預防作用。

2.3 小鼠肝臟抗氧化指標分析結果

由表5可知，與LFD組相比，HFD組小鼠的MDA水平顯著升高，SOD和GSH-Px活力顯著下降（P＜0.05）。而FHJ組和NFHJ組的MDA水平相比HFD組明顯降低，SOD和GSH-Px活力明顯升高，但與LFD組比較也具有一定差異。

表5 FHJ和NFHJ灌胃對小鼠肝臟抗氧化指標的影響Table 5 Effects of FHJ and NFHJ on liver antioxidant indexes in mice

MDA是脂質過氧化的產物，其在機體內的含量變化能夠定量反映生物膜的受損程度，并引發高血糖，研究證實肥胖患者體內MDA水平較高[18]。攝入FHJ和NFHJ均能夠降低小鼠肝臟組織中的MDA水平，可能是因為胡柚中含有豐富的多酚、黃酮類化合物等抗氧化成分，且益生菌的發酵也增加了這些物質在胡柚汁中的含量[19]，這些成分在機體內顯示出抗脂質過氧化的作用，從而減輕了氧化應激對肝臟的損傷。SOD能夠作用于自由基，緩解其對機體細胞的損傷，抑制脂質的過氧化，而GSH-Px能夠特異性催化還原型谷胱甘肽成為氧化型谷胱甘肽，從而保護細胞膜的結構和功能[20]。本實驗團隊前期測定了FHJ和NFHJ的體外抗氧化性指標，與NFHJ相比，FHJ對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力分別提高了4.3%、15.9%和0.7%以上[9]，FHJ的抗氧化作用可能與肥胖小鼠受損肝臟SOD和GSH-Px活性的恢復有關。

2.4 小鼠肝臟組織和脂肪細胞的切片分析結果

由圖4A可知，LFD組小鼠的肝臟呈現紅褐色，表面光滑，且肝臟的形態正常，而HFD組小鼠的肝臟體積偏大，顏色趨于淺紅，顆粒粗糙且有油膩感，肝臟組織彈性較差。FHJ組、NFHJ組小鼠肝臟在色澤、表面光滑度、組織彈性等方面較HFD組具有明顯改善。

圖4 小鼠肝臟組織學觀察（×200）Fig.4 Histological observation of liver tissue in mice (× 200)

由圖4B可知，LFD組小鼠肝臟組織油紅O染色面積較小，脂滴也很小，肝細胞形態正常；而HFD組肝臟組織中出現肝細胞脂肪變性，脂滴數目明顯增多且呈堆積狀，融合為大塊的紅色脂滴；相比之下，FHJ組肝臟切片紅色脂滴體積明顯減小，較為稀疏，呈小顆粒狀不均勻分布，與正常肝臟組織的形態最為接近；NFHJ組肝臟切片中紅色脂滴體積減小，但相對聚集成小片分布，肝細胞脂肪輕度變性。

肝臟是機體內脂類代謝的主要器官，攝入脂肪過多時，肝細胞會大量積累脂肪，甚至可能發生病變，形成脂肪肝[21-22]。實驗結果表明，HFD組小鼠因持續攝入高脂飼料造成肝臟細胞脂質沉積嚴重，發生病變，而FHJ組和NFHJ組小鼠的肝臟脂質沉積在不同程度上得到了緩解，這一結果也與表4中AST、ALT的水平變化結果相一致。有研究證實，通過攝入乳桿菌能夠顯著減少HFD小鼠的體質量增加和病原菌的數量，減輕肝臟組織脂肪變性[23]。FHJ能夠明顯地抑制高脂飲食導致的肝臟組織脂質積累，降低肝臟脂肪變性程度，防止脂肪肝等肝臟病變的發生。

為了觀察攝入胡柚汁對小鼠脂肪組織的影響，取小鼠附睪脂肪組織進行蘇木精-伊紅染色。由圖5可看出，LFD組正常小鼠的細胞體積較小，大小均一、飽滿，形態較為清晰。HFD組小鼠的細胞體積明顯增大，呈大空泡狀，細胞排列不規則，細胞膜不完全清晰，相交處可見融合現象。胡柚汁的干預使實驗組小鼠脂肪組織細胞的體積出現了不同程度的恢復，FHJ組和NFHJ組細胞的形態基本上較規則且飽滿，細胞體積減小，在視野范圍內細胞數目明顯增多，其中FHJ組的細胞體積更小。實驗結果表明，攝入FHJ和NFHJ均能夠抑制肥胖小鼠的脂肪組織脂質積累，改善脂肪細胞肥大，保護細胞形態，且FHJ的作用效果更好。這主要是因為新鮮胡柚汁中含有大量的生物活性化合物（主要有黃酮類、多酚類物質），這些活性化合物起到了主要的減脂作用。研究發現，多酚類物質進入體內會增加環腺甘酸的量從而刺激脂肪細胞的脂肪分解作用，加速脂肪細胞分解及轉化，持續作用能使脂肪形成記憶，能自覺地抑制多余脂肪再積聚[24]。同時越來越多的證據表明乳酸菌等益生菌在能量平衡調節和體質量控制方面起到重要作用[25]。益生菌調節高脂飲食誘導小鼠的肥胖機制可能是益生菌可以改善致胖飲食的負面作用， 主要是通過與共生細菌相互作用改變涉及碳水化合物代謝和丁酸合成途徑微生物代謝酶類的表達[26-27]。而益生菌發酵使果汁具有更完整的營養功能，本團隊前期測定了發酵前后胡柚中總酚、總黃酮的含量，發現發酵后的胡柚中總酚、總黃酮含量顯著增加[9]，這些活性成分保證了發酵果汁的高抗氧化能力，對血漿脂質代謝和肝臟抗氧化活性能夠產生積極影響[28]。

圖5 小鼠白色脂肪組織觀察結果（×200）Fig.5 Histological observation of white adipose tissue in mice (× 200)

3 結 論

乳酸菌FHJ能夠對肥胖小鼠發揮降脂作用，對肥胖癥狀產生積極的預防和緩解作用。攝入FHJ或NFHJ能夠顯著緩解肥胖小鼠的體質量增加，FHJ效果更好。攝入FHJ或NFHJ顯著降低了肥胖小鼠的血清TC、TG和LDL-C濃度，提高了血清HDL-C濃度，可調節肥胖小鼠的血脂代謝；顯著降低血清AST和ALT的水平，在一定程度上減輕了高脂飲食造成的肝臟損傷。攝入FHJ或NFHJ能夠改善由肥胖導致的機體內抗氧化水平降低，能顯著降低小鼠肝臟中的MDA水平，增強SOD和GSH-Px活性，有效改善肝臟氧化應激，提高肝臟抗氧化水平。FHJ能夠在一定程度上減少脂肪在肝臟和其他組織、器官中的累積，改善肝臟脂肪變性程度和脂肪細胞肥大，防止脂肪肝等肝臟病變的發生。綜上，本實驗對開發果蔬汁乳酸菌發酵加工具有一定的參考意義和推動作用。